善变的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞：CHO细胞系不稳定性问题的成因、影响及潜在缓解方法综述

潜在缓解方法综述

摘要

基于中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的重组蛋白生物生产如今在补料分批培养中通常可实现超过5克/升的滴度。这一进展部分归因于CHO细胞对各种基因操作和培养条件变化的快速适应性。其固有的可塑性基因组赋予了这种适应性；然而，这也使CHO细胞具有基因组重排的倾向。结合高产细胞的基因组和代谢需求，CHO细胞的可塑性在生物生产过程中表现为细胞系的不稳定性，表现为生产力和产品质量的下降。在这篇综述中，我们对滴度和质量稳定性进行了定义，并讨论了CHO不稳定性现象的主要原因以及克隆选择和基因操作方面的进展。我们还讨论了系统生物学方面的进展，这些进展能够为早期预测CHO细胞的不稳定性提供新的策略，这将有助于识别能够维持生产稳定性和可重复产品质量的多克隆细胞系，即使在长时间培养过程中也是如此。

1.引言

自2002年以来，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准316种生物治疗药物（包括生物类似药和联合用药）。过去四年中，每年的新增批准数量保持稳定；截至2018年8月，本年度已有5种新药获批，其中包括4种单克隆抗体（依瑞鲁单抗、替拉珠单抗、伊巴珠单抗、曲妥珠单抗）和1种生物类似药促红细胞生成素α-epbx。在2002年至今的新增批准类别中，单克隆抗体（新抗体及新适应症）占所有新药申请（NDA）和生物制品许可申请（BLA）批准总数的22%，占2008年以来所有生物类似药批准总数的30%（图1）。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系已成为生产重组治疗药物的首选，约70%的重组生物制药蛋白以及2016年以来获批的所有单克隆抗体（阿达木单抗、贝洛托珠单抗、阿维鲁单抗、度普利尤单抗、德瓦鲁单抗、奥瑞珠单抗、布罗达单抗）均通过CHO细胞系生产。研究表明，CHO细胞具有多种适合工业化生产的特性，如耐受基因操作、易于适应生产工艺规模、生长速度快，且具备进行人类兼容型翻译后修饰的固有能力。过去30年生物制药研发的诸多渐进式进展，促成了CHO细胞培养工艺的建立，其补料分批培养的滴度已达13g/L。在生物类似药兴起的时代，随着人们对蛋白质疗效的深入理解以及对法规合规性分析的重视，上游工艺开发面临的新挑战是生产大量电荷、分子量和疗效特征一致的重组蛋白。

已有研究提出，CHO细胞系核型中观察到的染色体重排和其他基因组变异，在一定程度上使部分细胞系具备了适应工业化生产的性能。然而，正是这种基因组可塑性，导致培养过程中常出现一个问题：细胞在长期培养过程中，甚至在最终生物反应器规模培养的延长时间内，重组蛋白产量可能会意外下降。已发现多种机制可导致这种不稳定性，例如基因丢失、基因沉默以及细胞应激敏感性增加。此外，凋亡增加、全局基因变化以及全基因组/表观基因组变化等远端因素也可能引发生产不稳定性。意外且不可预测的基因变化还可能导致与糖基化、蛋白质折叠、蛋白酶和分子伴侣相关的细胞基因表达改变。同时，生物制药生产过程易受温度、pH值、渗透压和氧传递等因素波动的影响，这些变化会动态干扰转录组。因此，局部转基因和全局宿主细胞基因组的偏差可能会意外导致工艺产量下降、影响项目进度、增加成本、改变蛋白质质量，并引发法规合规问题。研究还发现，所选细胞的特性往往会随时间丢失，且来自同一细胞群体的克隆株其特性可能存在显著差异。总体而言，多个实验室已达成共识：CHO细胞在生长和表型特性方面存在异质性，且随着时间推移会表现出基因组不稳定性。因此，生产过程中的稳定性无法长期保证。

本综述扩展了细胞系不稳定性的现有定义，将产品质量不稳定性纳入其中（图2）。文中列举了文献中已知的所有CHO细胞不稳定性成因，并讨论了通过这些机制克服不稳定性的当前研究进展。最后，我们探讨了开发新工具以加深对CHO细胞不稳定性理解的必要性。在CHO细胞系开发领域，持续创新和采用基于系统的方法来识别、监测并设计解决方案以彻底消除不稳定性，是当前的迫切需求。

2.细胞系稳定性的定义

任何工业生产过程都必须遵循严格标准，以确保产品的可重复性、合规性和质量。生物治疗药物生产过程具有独特性，其利用培养中的活细胞进行生产。尽管工程控制技术已相当成熟，但生物系统的重复样本仍可能出现预期偏差。在稳健且监测完善的工艺中，稳定细胞系可定义为具有以下特征的均质细胞群体：在70代内保持70%或以上的体积产率滴度（从主细胞库扩大到生产规模通常需要60代）。

与参考产品相比，在结构、功能、纯度、化学特性和生物活性方面无“临床意义上的差异”。长期稳定性研究的产率特征可分为以下几类（图3）：

理想型：在100代培养结束时，细胞产率滴度的偏差不超过15%（在测量误差范围内）。

稳定型：在超过60代的培养中，细胞测量值的偏差在检测方法的允许范围内。

渐进丢失型：在不到60代的多次传代过程中，细胞产率出现可测量的渐进式下降。

立即丢失型：在少数几代传代内，细胞产率突然急剧下降。

在典型的细胞系筛选流程中，转染后的细胞通过有限稀释接种进行克隆。最终筛选出的克隆株需具备高产率，并保持一致且可比的产品质量。在明确的生产工艺中，细胞系对质量属性的影响最为显著。事实上，培养物中的糖基化水平、蛋白酶表达、氨和乳酸水平均为克隆特性，对产品质量有重要影响。因此，有必要通过高通量检测监测所选优质克隆株的产品质量属性，如电荷分布分析和分子量分析，以确保筛选出具有理想宿主细胞特性和最佳且一致产品质量的克隆株。

据估计，8%-63%的重组CHO细胞系存在产品滴度不稳定性。早期生产不稳定性可能归因于表观遗传机制导致的转基因表达丢失，而渐进式稳定性丢失可能与非生产性亚群有关。然而，不稳定性与CHO宿主细胞的选择（DG44与CHO-K1）、扩增方法（谷氨酰胺合成酶（GS）筛选与二氢叶酸还原酶（DHFR）筛选）无关，且在有或无选择压力（如甲氨蝶呤（MTX）和蛋氨酸亚砜亚胺（MSX））的情况下均会发生；这使得该现象在当前细胞系开发流程中极为普遍。目前，关于这些参数对产品质量不稳定性的影响，相关数据尚不充分。

3.CHO细胞不稳定性表型的机制成因

尽管已有多种细胞系和产品出现不稳定性问题的报道，但最终滴度下降和/或偏离设定质量参数的现象仍是固有的且不可预测的。虽然CHO细胞不稳定性的成因尚未完全阐明，但以下是一些已被较好理解的分子机制（表1）。

4.CHO基因组的固有不稳定性

不稳定性的根本原因部分在于CHO细胞的基因组可塑性。CHO原始细胞在帕克实验室被永生化并建立，随后筛选出了生长速度更快的细胞群体。这些细胞含有11对染色体。此后，通过多次随机诱变和化学处理，生成了CHODG44和CHOK1宿主细胞。在CHO宿主细胞用于生物制造之前，可能已进行了数百次此类传代培养。除染色体异常外，长期培养中CHO细胞因转录错误导致的DNA模板突变背景率较高。这些观察结果表明，该细胞系的DNA修复和转录机制可能存在缺陷。测序结果还显示，CHO染色体的单倍体发生率较高。由于这种基因组不稳定性，某些克隆株可能最初具备生物治疗药物生产所需的所有理想特性，但随后可能出现基因型和表型漂移，导致产品滴度和质量发生变化。与生产细胞系相比，CHO宿主细胞的不稳定性尚未得到充分研究。由于生产细胞系是通过将转基因转染到宿主细胞中，然后筛选稳定表达转基因的克隆株（或细胞池）生成的，因此宿主细胞的基因组/染色体不稳定性可能会传递给生产细胞系。

5.基因组对产率丢失的影响

高拷贝数质粒的转染可导致重组DNA与宿主基因组整合。已知转基因整合位点会影响转基因的表达。例如，在高产细胞中，基因插入片段常出现在大型染色体上，而在低产或不稳定细胞中，基因整合更常发生在已知的脆性位点（基因组中特别容易发生DNA断裂的区域）。

用于生成克隆株的筛选系统也会影响转基因表达的稳定性。最常用的筛选系统是CHO-DG44宿主细胞的MTX筛选系统和CHO-GS宿主细胞的MSX筛选系统。MTX筛选方法的原理是抑制dhfr基因。在MTX处理过程中，DNA合成途径受到抑制，CHO细胞易发生严重的基因重排。

转基因的位置和拷贝数也会影响重组基因的表达。在MTX介导的扩增中，转基因整合是随机的，可能导致局部和远端出现多个拷贝。在多拷贝插入和显著基因扩增的情况下，克隆株往往会丢失这些拷贝（进而导致产率下降）。事实上，细胞持续高水平表达重组蛋白会带来巨大的代谢负担。细胞摆脱这种代谢负担的常见机制是通过自发地从宿主基因组中删除转基因。

即使在没有选择压力的情况下，CHO细胞也可能丢失拷贝数。这种转基因的自发丢失可能是DNA重排的结果。在扩增程度较低的系统（如MSX筛选系统）中，也可能出现产率下降，有报道称该系统中细胞克隆株的凋亡敏感性增加会导致基因表达丢失。

6.转录沉默

转录受多种因素影响，如DNA甲基化、核小体定位、组蛋白修饰和变异、转录复合物结合以及非编码RNA的调控。这些因素可独立或联合作用于重组表达。此外，转录水平的调控可独立于降低转基因拷贝数的基因组因素，已有报道称长期培养中在未丢失转基因拷贝数的情况下仍会出现产率下降。通常，强病毒启动子被用于驱动重组蛋白的表达；然而，这些启动子含有富含CG的区域，易通过甲基化发生沉默。有趣的是，何等人的研究报道，使用无CpG启动子可减少早期转基因沉默，但无法改善长期稳定性。事实上，已知生产细胞系中的组蛋白修饰模式会不断发生改变，导致转基因以及细胞蛋白的基因沉默。此外，对长期培养的抗体生产细胞的研究发现，全局组蛋白乙酰化水平降低，这表明生产稳定性和产品质量可能受表观基因组的影响。

7.基因组/表型漂移

从重组DNA进入宿主细胞核进行染色体整合，到克隆筛选，再到商业生产，整个过程可能需要数月时间。在此过程中，高产细胞系可能会表现出异质性表达模式或丢失重组蛋白的表达。有报道称，克隆筛选后，来自所选细胞池的克隆株其基因组均一性与所选单克隆株无显著差异。然而，在细胞系开发过程中已观察到表型漂移。多项研究表明，在分批或补料分批培养中，细胞遇到营养物质和代谢物浓度变化时，转录组会发生改变。在分批培养过程中以及生产周期内，为响应不断变化的培养环境，培养物中多达1400种mRNA的表达会受到差异调控。李等人的其他研究表明，在不稳定群体的长期培养中，基因表达变化更为频繁。值得注意的是，这些研究中的不稳定性并非由转基因拷贝数丢失或转录的局部表观遗传调控引起，而是由参与RNA转运、mRNA翻译和稳定性以及细胞周期调控的远端基因的差异调控导致，进而引起克隆表型的整体改变。此外，有报道称，经过50代以上传代后，膜联蛋白V和半胱天冬酶3的过表达会导致细胞对凋亡的敏感性增加，从而引发生产不稳定性[24]。研究表明，经过多次传代后，CHO细胞会因应激相关标志物的过表达和细胞代谢的改变而导致体积产率下降。

值得注意的是，蛋白质折叠和细胞应激通路常常相互重叠。对于产率达到数克每升的重组细胞系，培养物中应激标志物的增加可能表明存在一定程度的产品错误折叠和聚集。凋亡增加会导致蛋白水解性宿主细胞蛋白（HCP）释放到培养基中。HCP会增加无活性甚至有害片段和聚集物产生的风险。在延长的生产周期中，死亡细胞释放的HCP和存活细胞分泌的HCP在细胞外的积累水平远高于分批培养，从而可能影响产品质量。特别是，培养基中积累的蛋白酶和糖苷酶会对表达靶标的质量产生负面影响。除了CHO细胞在生产周期中的全局变化外，有报道称特定通路（如糖基化）可能在长期培养中被沉默。对于N-糖基化通路，在所检测的24个基因中，有21个在补料分批培养过程中表现出显著的差异调控，导致重组干扰素-γ的唾液酸化水平降低。

众所周知，CHO细胞系在适应/筛选过程中，甚至在标准培养过程中，经常发生染色体重排。由于在典型的细胞系开发过程中可能发生大量的单核苷酸变异（SNV）和点突变，亚克隆变异以及表型漂移引起的产品滴度和质量不稳定性的根本成因和缓解方法仍是一项挑战。

8.克服CHO细胞系不稳定性的策略

传统上，细胞系开发流程依赖于转基因在基因组中的随机整合。筛选/扩增可能导致转基因的局部扩增或远端扩增。然而，这种方法缺乏可控性，可能导致不必要的位置效应。此外，产生的多个拷贝可能会发生缺失或沉默，从而导致滴度不稳定性。同时，CHO细胞的基因组重排倾向、表观遗传变化、转录沉默和蛋白质组变化均会影响细胞系稳定性。为克服这些问题，相关机构会筛选和测试数百个克隆株以鉴定稳定的克隆株。以下是一些已成功应用于解决细胞系稳定性问题的策略。

8.1克服CHO细胞系稳定性的基因组障碍

为避免基因的随机插入，目前已开发出多种利用位点特异性核酸酶实现转基因定点整合的方法。多个研究小组报道，这些方法具有低脱靶效应、表达均一性好以及在多次传代中保持稳定表达的特点。如今，随着CHO细胞详细基因组序列的获得，可以更精确地定制CHO细胞中的定点整合。

考虑到CHO细胞的诱变历史以及主要CHO-DG44和CHO-K1宿主细胞中染色体单倍体的普遍性，工业平台正逐渐转向使用CHO-GS敲除细胞宿主。该细胞系通过锌指核酸酶基因编辑技术生成，而非化学诱变。此外，该细胞系无需多步扩增，因此在下游细胞筛选方法中，转基因缺失和沉默的可能性降低。

未来，预测细胞系稳定性具有重要价值。如果任何不稳定性是由基因组重排引起的，可通过细胞核型分析检测这些变化，并将其作为生产不稳定性的标志物和指示物。

8.2克服CHO细胞系稳定性的转录障碍

转基因沉默导致的产率下降已被广泛报道，目前已有多项研究致力于提高转基因的表达。例如，已将多种调控元件整合到表达载体中以增强重组蛋白的表达。基质附着区（MARs）是基因组DNA序列，在分裂间期作为DNA与核基质结合的附着位点。研究表明，MARs可提高CHO细胞表达系统中的转基因表达水平以及阳性克隆的比例。有报道称，将MARs元件与强载体结合使用，可使成功转染的细胞数量增加，产率提高超过12倍，且在培养过程中能更好地维持表达。其他一些染色体元件，如基因座控制区（LCRs）和泛染色质开放元件（UCOEs），也被用于重组蛋白生产，在维持转基因的持续转录和补料分批培养中的稳定生产方面均取得了进展。除载体工程外，使用合成启动子、无CpG启动子和巨细胞病毒（CMV）突变体已生成转基因沉默倾向降低的克隆株。除了提高转基因的产率外，载体元件还能使重组蛋白在多次传代中保持稳定表达。

8.3克服表型漂移引起的CHO细胞系稳定性障碍

CHO细胞在工业上广泛应用的主要原因之一是其表型适应性和可塑性。事实上，可通过筛选CHO细胞获得多种截然不同的表型，如抗病毒感染和表达特定糖型。尽管取得了这些成功，但持续的表型漂移仍是一个固有问题。白克和李的一项研究调查了CHO-DUK细胞及其亚克隆株的染色体重排情况。结果表明，在无代谢负担或其他选择压力的情况下，宿主细胞中的克隆株表现出核型异质群体。这一观察结果表明，即使在常规传代培养过程中，也会发生染色体重排。由于不稳定性是细胞活动多种变化的结果，系统生物学方法将有助于更好地理解和克服稳定性问题。改进的中国仓鼠参考基因组的获得将为基因组工程研究提供支持。此外，已有多项研究致力于确定最佳整合位点，以提高生成蛋白质生产稳定的细胞群体的可能性。同样，利用改进的基因组序列，宿主细胞工程研究可帮助去除影响产品质量的蛋白酶。在最近的一项研究中，来自改进基因组组装的新信息被用于鉴定与难以去除的宿主细胞蛋白具有相似预测功能和特征的靶点。尽管可能存在一些益处，但在不久的将来，相关领域不太可能放弃使用CHO细胞。因此，当前的需求包括理解不稳定性的生物学机制、鉴定生物标志物，以及在细胞系开发的早期阶段纳入基于生物信息学的基因组挖掘，以鉴定稳定的克隆株。作为早期实例，研究已揭示线粒体功能在维持高产细胞的生物合成能力方面的重要性。这些基因和通路的鉴定可初步作为鉴定长期培养中稳定生产株特征的标志物。

9.讨论

目前，CHO细胞的产率已达到相当高的水平，工艺开发的瓶颈通常在于下游加工步骤。随着首批生物治疗药物专利到期，生物类似药的生产需要更稳定的产品滴度，以控制生产成本并确保产品质量稳定性。随着病毒抗原、疫苗以及双特异性和三特异性抗体（具有多个独特结合位点的单克隆抗体）等新型生物分子进入生产管线，产品质量维持可能会优先于进一步提高产率。此外，生产周期的总生产成本分析表明，细胞培养工艺对总成本的影响较小。因此，有必要在细胞系开发过程中纳入筛选步骤，通过鉴定稳定性标志物，筛选出能够提供稳定且一致产品的细胞系，且不影响交付成本。我们还认为，加大对生产不稳定性问题的研究力度，将有助于理解导致不稳定性的所有途径。重组转基因拷贝数丢失、转基因沉默和整体表型漂移只是与这一复杂现象相关的部分因素。预测细胞系稳定性，并最终设计细胞系工程策略以预防不稳定性，是非常令人兴奋的研究方向，且随着该领域向集成连续生物加工方法的发展，这可能是必要的步骤。