一种高效稳定剂的研发及其在口蹄疫疫苗抗原长期储存中的应用

摘要：口蹄疫分离株O/SKR/JC/2014（OJC）结构不稳定，难以制备和保存足量的完整疫苗抗原。基于这一特性，本研究以OJC毒株为模型病毒开展稳定性研究，旨在确定最优稳定剂组合，实现口蹄疫疫苗抗原在水相和冷冻相中的长期储存。结果发现，与常规使用的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（TBS）或磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）储存的OJC疫苗抗原相比，在三羟甲基氨基甲烷-氯化钾缓冲液（TK）中储存的抗原在4℃和-70℃条件下保质期更长。此外，10%蔗糖与5%乳清蛋白水解物联合使用，可在水相状态下保护OJC 146S颗粒免受大量结构破坏，有效期长达一年。该稳定剂组合对其他口蹄疫病毒（FMDV）毒株同样有效，包括A型和Asia 1型血清型。借助该稳定剂组合，口蹄疫疫苗抗原在常规生产过程中可灵活保存，既能在冷藏条件下临时存放，也能在超低温冷冻条件下进行库存储备。

关键词：口蹄疫（FMD）；缓冲液；赋形剂；稳定剂；病毒；疫苗抗原

1 引言

口蹄疫（Foot-and-mouthdisease, FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus, FMDV）引起的一种高度传染性水疱病，主要感染偶蹄动物。为预防其暴发，许多国家正在对牛、猪等易感家畜进行疫苗接种。口蹄疫疫苗主要由灭活病毒颗粒和佐剂组成。完整的病毒颗粒因其沉降系数被称为146S颗粒，由60个原聚体组成。每个原聚体包含一组结构蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4），五个原聚体组装形成五聚体，12个五聚体与包裹的病毒RNA共同构成146S颗粒。已知完整病毒颗粒及空心衣壳（75S）对免疫动物具有最强的保护性免疫作用，而五聚体（12S）的免疫保护效果较差；然而，146S颗粒在弱酸或温和加热条件下易解离为免疫原性较弱的12S颗粒。因此，维持146S颗粒的稳定性是口蹄疫疫苗生产的关键技术。

此前，许多研究致力于通过基因操作病毒结构蛋白的特定编码序列，获得热稳定或耐酸性的口蹄疫病毒146S颗粒。然而，通过基因修饰实现病毒颗粒结构稳定化可能会反过来阻碍病毒脱壳和复制过程。此外，该技术无法应用于野生型口蹄疫病毒的疫苗抗原生产。因此，研究人员转而寻求通过将疫苗抗原悬浮于含添加剂的适宜缓冲液中以实现稳定化的策略。

已有研究表明，口蹄疫病毒衣壳的稳定性受缓冲液中不同浓度盐类的影响。此外，多种添加剂已被证实对包括口蹄疫病毒在内的病毒稳定化有效。尽管上述研究在一定程度上提高了病毒的稳定性，但这些组合能否真正延长口蹄疫疫苗抗原在水相中的数月保质期，或保护抗原免受冻融损伤，仍不明确。

在常规疫苗生产过程中，疫苗抗原处于悬浮状态，根据制造商的批量生产体系，在与佐剂进行最终配方混合前，可能需要储存数天至数周。此外，疫苗抗原可通过冷冻状态进行长期储存或存入抗原库。由于口蹄疫病毒以其极高的不稳定性而闻名，生产过程中的146S抗原稳定化技术尚未公开，且被商业疫苗公司列为知识产权予以保护。本研究引入韩国分离的高度不稳定O型毒株作为稳定性研究的实用模型病毒，旨在提供一种实用的缓冲液和赋形剂组合，实现口蹄疫疫苗抗原在水相和冷冻相中的长期储存。

2 材料与方法

2.1 疫苗抗原的制备

本研究使用了四株口蹄疫病毒，O/SKR/JC/2014（OJC）、O/SKR/BE/2017（OBE）和A/SKR/YC/2017（AYC）毒株为韩国本土分离株，而Asia1/Shamir/ISR/1989（As1Shamir）毒株为外来毒株。将各株口蹄疫病毒以0.002的感染复数（MOI）接种于BHK21悬浮细胞，在37℃、5%CO₂振荡培养箱中以110rpm转速培养。感染后16小时，通过离心（4000×g，20分钟）收集澄清的病毒培养上清液。

随后，加入3mM二元亚乙基亚胺对病毒进行灭活处理，并在26℃振荡培养箱中孵育24小时。使用2%硫代硫酸钠淬灭残留的BEI。向灭活的口蹄疫病毒培养上清液中加入终浓度为7.5%（w/v）的聚乙二醇6000（PEG6000）和0.5M氯化钠进行浓缩。通过离心（10,000×g，30分钟）收集沉淀物，通过蔗糖梯度超速离心进一步纯化。将纯化后的146S抗原重悬于各种缓冲液和赋形剂组合中。

2.2 缓冲液和赋形剂

三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（TBS）的基本组成为50mM Tris-HCl和100mM NaCl（pH7.6），而三羟甲基氨基甲烷-氯化钾缓冲液（TK）的基本组成为20mM Tris-HCl和300mM KCl（pH7.6）。磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）由154mM NaCl、5.6mM Na₂HPO₄和1mM KH₂PO₄组成（pH7.6），可单独使用或添加150mM NaCl和50mM MgCl₂制成PNM缓冲液（pH7.6）。TNE缓冲液通过向TBS中添加1mM乙二胺四乙酸（pH7.6）制备，KP缓冲液由600mM磷酸钾和500mM KCl组成（pH7.6）。对于组合赋形剂，蔗糖和乳清蛋白水解物按指定的百分比（w/v）浓度使用。

2.3 146S颗粒定量

采用蔗糖密度梯度（SDG）分级分离法或体积排阻高效液相色谱（SE-HPLC）法对146S颗粒进行定量。对于蔗糖密度梯度分级分离，将样品溶液铺在15%-45%蔗糖密度梯度上，使用SW41Ti转子在4℃、100,000×g条件下再次超速离心4小时。使用连续密度梯度分级仪对超速离心后的蔗糖密度梯度进行分级，并用该仪器的分光光度计组件记录各组分在254nm处的吸光度。根据先前的研究，通过测量特定组分的峰面积来计算146S抗原的量（μg/mL）。在体积排阻高效液相色谱分析中，使用安捷伦1260InfinityII系统，该系统由带在线脱气器的四元泵、带样品冷却器的自动进样器、恒温柱温箱和工作波长为254nm的可变波长检测器组成，搭配TSKgel G4000PWXL色谱柱（300mm×7.8mm内径）和TSKgel PWXL保护柱（40mm×6.0mm内径）进行分析。如先前研究所述，样品在分析前用核酸酶处理，以消化宿主细胞来源的DNA。流动相由30mM Tris-HCl和400mM NaCl组成（pH8.0），流速设定为0.5mL/min。使用软件对目标峰的峰面积进行积分，并根据先前的研究计算146S抗原的量（μg/mL）。

2.4 稳定性测试

为比较各口蹄疫病毒毒株的稳定性，将各毒株20μg/mL的146S抗原悬浮于TBS（pH7.6）中，在45℃下加热，并在加热后1、2、5、15和30分钟收集样品。对于长期储存测试，将OJC口蹄疫疫苗抗原悬浮于各种缓冲液和赋形剂组合中，以液体形式在4℃或-70℃下储存长达一年。在每个时间点按以下公式计算回收率：储存或加热后的146S抗原含量/储存或加热前的146S抗原含量×100%。通过在50℃下加热30分钟进行加速稳定性测试，以验证所选缓冲液和赋形剂组合对OJC以外的其他口蹄疫病毒毒株的有效性。以TK缓冲液中含10%蔗糖和5%乳清蛋白水解物（SLA）的抗原含量为100%，计算加热后146S抗原剩余含量的相对回收率（%）。

2.5 透射电子显微镜观察

使用透射电子显微镜（TEM）观察完整口蹄疫病毒颗粒的形态。将经聚乙二醇浓缩后储存在各测试组合中的疫苗抗原铺在蔗糖梯度上，在100,000×g条件下超速离心4小时。收集30%-35%蔗糖层之间的条带，在100,000×g条件下超速离心4小时。将所得沉淀物在4℃下用TK缓冲液（pH7.6）透析以去除残留蔗糖。使用透射电子显微镜观察口蹄疫病毒颗粒。

3 结果

3.1 鉴定O/SKR/JC/2014（OJC）为高度不稳定的病毒

将包括OJC、OBE、AYC和As1Shamir在内的四株口蹄疫病毒悬浮于常规TBS（pH7.6）中，在45℃下加热30分钟后，除OJC外，其他所有毒株的146S含量均缓慢下降，30分钟后损失率低于20%（图1）。然而，OJC表现出急剧下降，5分钟后初始146S含量损失50%，30分钟后完全解离（图1）。因此，确定OJC口蹄疫病毒与其他口蹄疫病毒毒株相比具有典型的不稳定性。

图1  O/SKR/JC/2014口蹄疫病毒的热不稳定性。将O/SKR/JC/2014（OJC）、O/SKR/BE/2017（OBE）、A/SKR/YC/2017（AYC）和Asia1/Shamir/ISR/1989（As1Shamir）口蹄疫病毒在45℃下加热，基于蔗糖密度梯度分级分离法测定的抗原量，计算每个时间点（1、2、5、15和30分钟）的146S抗原回收率（%）。

3.2 OJC口蹄疫疫苗抗原短期储存的缓冲液筛选

将OJC口蹄疫病毒悬浮于各种缓冲液中，分别在4℃或-70℃下储存，以评估常用缓冲液对病毒抗原解离的保护能力。在水相和冷冻相状态下，储存4周后PBS中的OJC疫苗抗原减少最为显著。虽然PNM是水相中疫苗抗原的最佳缓冲液，但在冷冻相中效果不佳。此外，TNE虽然在冷冻相中表现出良好的稳定缓冲液性能，但在水相中的保护作用不大。TBS和KP在两种相中均表现出中等程度的保存效果。TK是唯一在两种相中储存4周后能将疫苗抗原损失控制在10%以内的缓冲液（图2a、b）。以TBS为对照，通过透射电子显微镜观察各相中效果最佳的两种缓冲液处理的样品。与在两种温度条件下均显示病毒颗粒降解的TBS不同，TK和每种温度下选择的另一种缓冲液几乎未显示任何形态异常（图2c、d）。

图2  缓冲液对OJC口蹄疫疫苗抗原短期储存的有效性。(a)4℃储存4周期间各缓冲液中146S颗粒回收率（%）；(b)-70℃储存4周期间各缓冲液中146S颗粒回收率（%）。(c)水相储存的146S颗粒显微镜观察结果；(d)冷冻相储存的146S颗粒显微镜观察结果。箭头指示降解的颗粒。缩写：TBS，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（pH7.6）；PBS，磷酸盐缓冲盐溶液（pH7.6）；PNM，添加NaCl和MgCl₂的PBS（pH7.6）；TNE，添加乙二胺四乙酸的TBS（pH7.6）；TK，三羟甲基氨基甲烷-氯化钾缓冲液（pH7.6）；KP，磷酸钾缓冲液（pH7.6）。

3.3 候选缓冲液对OJC口蹄疫疫苗抗原长期储存的有效性

对各相中鉴定出的短期储存有效的两种最佳缓冲液以及作为对照的TBS进行长达一年的长期储存评估。在水相状态下，3个月后没有缓冲液能有效保存OJC口蹄疫疫苗抗原（图3a）。同样，在冷冻相中，一年后没有缓冲液能将OJC的回收率维持在90%以上，TK的146S回收率在6个月前没有显著下降，但在12个月时为81.41±0.29%（图3b）。

图3  缓冲液对OJC口蹄疫疫苗抗原长期储存的有效性。(a)4℃储存一年期间各缓冲液中146S颗粒回收率（%）；(b)-70℃储存一年期间各缓冲液中146S颗粒回收率（%）。

3.4 所选缓冲液与赋形剂联合使用的有效性

基于对多种赋形剂组合的初步筛选，选择已知对口蹄疫病毒稳定有效的20%蔗糖（Suc）和SLA（10%蔗糖+5%乳清蛋白水解物）与TK缓冲液进行长期保存测试。与单独使用TK相比，两种赋形剂组合的使用均增强了OJC疫苗抗原在水相中的稳定性。特别是，TK缓冲液中的SLA，在4℃下储存12个月仍能保持90%以上的抗原保存率（图4a）。同时，单独使用TK在冷冻相中表现出的抗原回收率轻微下降，在TK中添加Suc或SLA作为赋形剂时未观察到（图4b）。

图4  赋形剂对OJC口蹄疫疫苗抗原长期储存的有效性。(a)4℃储存一年期间各缓冲液中146S颗粒回收率（%）；(b)-70℃储存一年期间各缓冲液中146S颗粒回收率（%）。虚线设定为90%回收率。缩写：TK，三羟甲基氨基甲烷-氯化钾缓冲液（pH7.6）；Suc，20%蔗糖；SLA，10%蔗糖+5%乳清蛋白水解物。

3.5 候选稳定剂组合与其他口蹄疫病毒毒株的相容性

为确定TK缓冲液中SLA在OJC口蹄疫病毒长期储存中显示的稳定作用是否适用于其他口蹄疫病毒毒株，将各毒株的146S抗原悬浮于TBS（pH7.6）中，在45℃下加热30分钟进行加速稳定性测试。结果发现无论何种血清型，口蹄疫病毒的146S抗原在含SLA的TK缓冲液中最为稳定。尽管SLA与常规TBS联合使用时也能提高热稳定性，但不如含SLA的TK缓冲液中的样品效果好（图5）。

图5  候选稳定剂组合与其他口蹄疫病毒毒株的相容性。以含SLA的TK缓冲液中的抗原含量为100%，计算在50℃下加热30分钟后146S抗原剩余含量的相对回收率（%）。缩写：OBE，O/SKR/BE/2017；AYC，A/SKR/YC/2017；As1Shamir，Asia1/Shamir/ISR/1989；TBS，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（pH7.6）；TK，三羟甲基氨基甲烷-氯化钾缓冲液（pH7.6）；SLA，10%蔗糖+5%乳清蛋白水解物。

4 讨论

在口蹄疫病毒的七个血清型中，O型和南非型（SAT）尤其不稳定。OJC属于东南亚（SEA）拓扑型病毒（Mya-98谱系），是我们之前研究过的最不稳定的O型血清型毒株。在45℃温和加热30分钟后，OJC毒株完全解离为12S亚基，而在相同条件下，包括另一种O型血清型病毒在内的其他测试毒株仍能保持80%以上的初始含量（图1）。在本研究中，因OJC毒株高度不稳定的特性，我们将其作为稳定性研究的病毒模型，来实时高效地分析缓冲液和赋形剂的稳定能力。

在146S抗原的储存测试中，使用了口蹄疫病毒研究中常用的缓冲液。其中，TK缓冲液表现出中等程度的保存能力，在4℃水相条件下可维持初始抗原含量的60%以上长达3个月。此外，TK缓冲液在-70℃冷冻相中的146S抗原回收率在测试缓冲液中最高。然而，单独使用TK缓冲液而不添加额外赋形剂，随着储存时间的延长，无论是在4℃水相还是-70℃冷冻相中，抗原回收率均显著下降。

此前，Harmsen等人报道，当TK缓冲液中添加30%蔗糖和1%牛血清白蛋白（BSA）并制成基于Marcol52的双油乳剂疫苗时，在4℃下长期储存对口蹄疫病毒的稳定化有效，而10%蔗糖和1%牛血清白蛋白的组合则无效。然而，30%蔗糖在4℃时粘度太高，若用于疫苗抗原，可能会给下游工艺（包括过滤）带来负担，因为根据达西定律，滤液的流速与液体粘度呈负相关。此外，牛血清白蛋白是一种众所周知的过敏原，在人用疫苗中其残留量不得超过50ng/剂量。此外，在兽医领域，已有多例疫苗接种后发生过敏反应的报告，且发现牛血清白蛋白是免疫球蛋白E（IgE）反应性疫苗成分之一。本研究中使用的乳清蛋白水解物是通过乳清蛋白的酶促水解合成的小分子肽和氨基酸复合物，过敏性低。

同时，据报道20%蔗糖（Suc）可提高O/China/1999口蹄疫病毒的热稳定性，在本研究中，其在4℃下对OJC疫苗抗原的稳定化作用在3个月内仍然有效；然而，3个月后未能显示出足够的保存效果。尽管已有报道称10%蔗糖与5%乳清蛋白水解物（SLA）在4℃下对冻干口蹄疫疫苗抗原的长期储存有效，但冻干技术本身是保存蛋白质等易腐物质最常用的技术，特别适用于最终产品。在本研究中，我们发现当SLA与TK缓冲液联合使用时，不仅在未干燥的冷冻相中，而且在水相中，均能有效长期保存口蹄疫疫苗抗原。先前有研究表明，5%葡聚糖、1%谷氨酸钠和5%蔗糖的混合物在4℃下对冻干口蹄疫疫苗抗原的长期保存效果与SLA相似，但在初步筛选后未进一步测试，因为它反而加剧了OJC疫苗抗原在水相中的不稳定性。

由于溶液的pH值不仅会影响蛋白质氨基酸残基的化学完整性，还会影响蛋白质高级结构的维持，因此选择合适的缓冲液对于蛋白质药物（包括口蹄疫病毒的146S抗原，其在弱酸性pH下易解离为12S颗粒）至关重要。根据先前的研究，Tris-HCl缓冲液的pH值从25℃时的7.37略微升高至-30℃时的8.54，而磷酸钠缓冲液的pH值从25℃时的7.0急剧下降至-30℃时的3.36。因此，使用基于Tris的缓冲液比磷酸盐缓冲液更合理，能够在水相和冷冻相中均维持中性至弱碱性pH值。此外，生理盐类（如氯化钾）已被用作蛋白质制剂中的等渗剂。据报道，与阳离子相比，氯离子能选择性地积累在蛋白质表面，并直接影响蛋白质的构象完整性和稳定性。蔗糖作为渗透剂，在液态下通过优先水合作用稳定蛋白质。乳清蛋白水解物由多种氨基酸组成，包括组氨酸、精氨酸和甘氨酸，这些氨基酸通过多种机制（如优先水合作用、直接结合、缓冲作用和抗氧化作用）稳定蛋白质。因此，TK缓冲液中SLA的各组成成分各自的稳定能力有望协同发挥作用。

在本研究中，我们通过长达一年的实时分析验证，无论是在水相还是冷冻相中，TK缓冲液中的SLA能够稳定保存高度不稳定的OJC口蹄疫病毒146S抗原。尽管实时分析仅针对OJC毒株进行，但由于其他毒株在常规TBS条件下的常规生产过程中均无问题，因此推测该稳定剂组合可能适用于其他毒株。在加速稳定性测试中，为确认该稳定剂组合对其他毒株的广泛适用性，所有测试毒株在含SLA的TK缓冲液中均表现出最高的热稳定性，尽管单独使用TK缓冲液或SLA也能轻微提高测试口蹄疫病毒的热稳定性。

5 结论

总之，采用TK缓冲液中的SLA保存口蹄疫疫苗抗原具有以下价值：首先，有利于水相和冷冻相之间的相变，这在生产过程突然中断的情况下可能需要；其次，其成分在病毒疫苗领域被普遍认为是安全的；最后，它使得具有典型不稳定性的口蹄疫病毒毒株能够像其他常规毒株一样被处理。

尽管需要进一步研究通过确定哪些氨基酸残基参与特定环境中显示的这种稳定作用，来阐明OJC毒株脆弱性的根本原因，但本研究首次确定了实用的稳定剂组合，不仅可广泛应用于口蹄疫研究实验室，也可应用于口蹄疫疫苗生产设施。