猪丁型冠状病毒S1基因的原核表达

摘要：本研究以构建猪丁型冠状病毒（PDCoV）S1基因原核表达载体为目的。采用RT-PCR从PDCoV临床分离毒株SCMS中扩增出S1基因，并将其插入到pET28a(+)表达载体中，构建重组质粒pET28a-S1。pET28a-S1经酶切、测序鉴定正确后，转入E. coli BL21( DE3)中，利用IPTG进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳分析证实PDCoV的S1基因获得了表达，且最佳表达条件为19℃、IPTG终浓度1.2 mmol/L诱导表达12小时。以上研究结果为建立PDCoV间接ELISA检测方法奠定了基础。

关键词：猪丁型冠状病毒；S1基因；原核表达；最佳诱导表达条件

Abstract：This study aimed to clone the porcine deltaconoravirus (PDCoV) S1 gene and construct its prokaryotic expression system.The S1 gene from a clinical isolate SCMS of PDCoV was amplified by RT-PCR and cloned into pET28a(+) plasmid. After the recombinant plasmid was identified by enzyme digestion and sequencing, it was transferred into E. coli BL21 (DE3) and induced by IPTG. The results of SDS-PAGE confirmed that the expression of PDCoV S1 gene was successful, and the optimal expression condition was 19°C, and 1.2 mmol/L IPTG to induce expression for 12 hours. The above results laid the foundation for the establishment of PDCoV indirect ELISA assay.

Key words：porcine deltaconoravirus ; S1 gene ; prokaryotic expression ; optimal expression condition

猪丁型冠状病毒（porcine deltaconoravirus，PDCoV）是近年发现的一种新型猪肠道病病原，主要感染猪的小肠，尤其是空肠和回肠部位，能引起严重的萎缩性肠炎[1]。PDCoV与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒同属冠状病毒，临床发病症状相似，主要为呕吐、水样腹泻和脱水，对于PDCoV的鉴别诊断需要借助实验室手段。PDCoV引起仔猪的死亡率约为30%~40%[2]。

PDCoV属于套式病毒目冠状病毒科冠状病毒属，病毒粒子呈球形或椭圆形等多形性，囊膜上有冠状棘突，除棘突外，病毒颗粒直径约为80~160 nm[2]。该病毒基因组为单股正链RNA，全长约25.4 kb，是目前已知冠状病毒中基因组最小的[3]。基因组构成和排列顺序为5'UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-N-3'UTR[4]。

PDCoV S蛋白是该病毒的纤突蛋白，主要参与病毒与宿主细胞的吸附和融合，同时也是诱导宿主产生中和抗体的主要抗原分子[5]。在病毒成熟过程中，S蛋白被蛋白酶切割成S1和S2。S1区域影响病毒与宿主细胞的识别与结合，也包含了病毒主要的中和表位，而S2区域主要作用是影响病毒与细胞的融合。本研究利用原核表达系统构建了表达PDCoV SCMS株S1蛋白的重组菌pET28a-S1/BL21。

1材料和方法

1.1载体和菌株

表达载体pET28a(+)、E. coli DH5α和E. coli BL21(DE3)由华派生物质检研发中心保存。

1.2毒株、细胞和阳性血清

PDCoV SCMS毒株由华派生物质检研发中心分离、鉴定及保存；ST细胞由华派生物质检研发中心保存；PDCoV阳性猪血清由华派生物质检研发中心制备及保存。

1.3主要试剂

T4 DNA Ligase和限制性内切酶Bam HI、XhoI购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒、通用型DNA纯化回收试剂盒、病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒均购自天根生化科技有限公司。

1.4 PDCoV病毒液的制备

将保存的第25代PDCoV SCMS株细胞毒按照5%接毒量接种于ST单层细胞，37℃培养，当细胞病变达到80%时，将病毒液反复冻融三次，收获病毒液。

1.5引物的设计与合成

根据PDCoV SCMS毒株S1基因序列及GenBank中公布的PDCoV CHN-HG-2017株序列（GenBank登录号MF095123）设计一对特异性引物，并分别在上、下游引物中加入BamHI和XhoI酶切位点。引物由上海英潍捷基有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列

1.6 PDCoV总RNA的提取及S1基因的RT-PCR扩增

取200 μl病毒液，参照试剂盒说明书用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒进行总RNA的提取。采用PrimeScript RT reagent Kit合成病毒cDNA，以cDNA为模板扩增S1基因片段。PCR扩增体系为：反转录产物（cDNA）1 μl，2×Taq PCR Ｍaster Mix 12.5 μl，上下游引物各1 μl，ddH2O 9.5 μl。反应程序为：95℃，5 min；95℃，45 s；56℃，30 s；72℃，2.5 min；30个循环；72℃，10 min。反应结束后，对PCR产物进行核酸电泳鉴定。

1.7 重组质粒pET28a-S1的构建与鉴定

S1基因片段和pET28a（+）载体用限制性内切酶BamH、Xho酶切处理后，用T4 DNA Ligase将S1基因片段连接至pET28a（+）载体。将连接产物转化E. coli DH5α，转化后菌液涂布在LB(含有50 μg/ml卡那霉素)固体培养基上，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于LB(含有50 μg/ml卡那霉素)液体培养基，37℃振荡培养过夜，用S1F/S1R引物进行菌液PCR初步鉴定。初步鉴定正确后，采用质粒小提试剂盒提取质粒，进一步用限制性内切酶BamHI、 XhoI对重组质粒进行双酶切和测序鉴定，阳性质粒命名为pET28a -S1。

1.8 重组菌pET28a-S1/BL21的获得

将鉴定正确的重组质粒pET28a-S1转化至E. coli BL21( DE3)，然后将转化后菌液涂布在LB(Kan+)固体培养基上，37℃培养过夜。

1.9 S1重组蛋白的诱导表达及鉴定

挑取LB(Kan+)固体培养基上单菌落，接种于1ml LB(Kan+)液体培养基，37℃振荡培养5小时，将培养的菌液按1:100的比例加入到100 ml的LB(Kan+)液体培养基中，待其OD600nm达到0.6-0.8的范围时，加入IPTG溶液，使其终浓度为1.0 mmol/L，在37℃诱导，同时设置空载体诱导表达对照组。将诱导表达后的菌液进行4℃，5000r/min离心10 min，离心结束后弃去上清液，加入50 ml的PBS洗涤菌体，重复一次洗涤过程，加入20 ml的PBS重悬菌体。重悬后的菌液在冰浴条件下进行超声破碎，功率为20%，工作4 s，间歇8 s，破碎15 min。取破碎后样品进行SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白表达情况。以PDCoV阳性猪血清为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，对重组蛋白进行Western-blot鉴定。

1.10 S1蛋白可溶性鉴定

诱导表达后的pET28a-S1/BL21菌液经超声破碎处理，取破碎后样品1 ml，在4℃条件下，12000 r/min离心30 min，分离上清和沉淀，沉淀用相同体积的PBS溶液重悬，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE 电泳分析。

1.11 S1蛋白表达条件优化

1.11.1 不同诱导时间目的蛋白的表达

当培养的pET28a-S1/BL21菌液OD600nm达到0.8时，加入IPTG，使IPTG终浓度达到1.0 mmol/L，在37℃条件下分别诱导表达6小时、12小时。诱导表达后的菌液经超声破碎，进行SDS-PAGE电泳分析。

1.11.2 不同诱导剂浓度下目的蛋白的表达

当菌液OD600nm达到0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度分别为0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L、1.5 mmol/L后，在37℃条件下以最佳诱导时间诱导表达。诱导表达后的菌液经超声破碎，进行SDS-PAGE电泳分析。

1.11.3 不同诱导温度下目的蛋白的表达

当菌液OD600nm达到0.8时，分别在19℃、37℃条件下，以上述选择的最佳诱导时间和IPTG浓度诱导表达。诱导表达后的菌液经超声破碎处理，进行SDS-PAGE电泳分析。

2结果

2.1 S1基因的扩增

利用RT-PCR方法扩增出PDCoV SCMS的S1基因，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析与预期大小一致，约为1.7 kb（图1）。

图1 S1基因RT-PCR扩增结果

Fig.1 The RT-PCR result of S1 gene

1：S1基因扩增产物 ；2：DL2000 DNA Marker；3：阴性对照

1: The RT-PCR product of S1 gene ; 2: DL2000 DNA Marker ; 3: Negative control

2.2 重组质粒pET28a-S1鉴定

挑取6个单菌落摇菌培养，将其依次命名为1号菌液、2号菌液、…、6号菌液。利用菌液PCR初步鉴定，结果显示均得到一条与目的片段S1基因大小一致的电泳条带（图2）。采用质粒小提试剂盒提取3号质粒，进一步用限制性内切酶BamHI、XhoI对质粒进行双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示有两条电泳条带，大小约为1.7 kb、5.3 kb，与预期相符（图3）。将3号质粒送生物公司测序，测序结果与PDCoV SCMS毒株的S1基因碱基序列一致，证明3号是阳性质粒pET28a-S1。

图2 菌液PCR鉴定结果

Fig.2 The PCR results of bacterial liquid

1：DL2000 DNA Marker；2：阴性对照；3~8：1~6号菌液

1: DL2000 DNA Marker ; 2: Negative control ; 3~8: Bacterial liquid of No. 1 to No. 6

图3 重组质粒酶切鉴定结果

Fig.3 Identification of recombinant plasmid by enzyme digestion

1：BamHⅠ和XhoⅠ酶切质粒；2：DL2000 DNA Marker

1: pET28a-S1 digested with BamHⅠand XhoⅠ; 2: DL2000 DNA Marker

2.3 重组菌种的诱导表达和鉴定

诱导pET28a-S1/BL21表达后，超声破碎重组表达菌，经SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后可明显观察到pET28a-S1/BL21表达了与预期大小相符的蛋白（图4）。Western-blot结果证实该蛋白可与抗PDCoV阳性血清发生特异性反应，该蛋白是S1蛋白（图5）。

图4 重组菌种的表达结果

Fig.4 Expression of pET28a-S1/BL21

1：空载体对照；2：pET28a-S1/BL21诱导表达；3：蛋白标准分子量

1: The blank vector control ; 2: Expression of pET28a-S1/BL21 ; 3: Protein Marker

图5 Western-blot结果

Fig.5 Western-blot analysis

1：空载体对照；2：pET28a-S1/BL21诱导表达；3：蛋白标准分子量

1: The blank vector control ; 2: Expression of pET28a-S1/BL21 ; 3: Protein Marker

2.4 S1蛋白可溶性鉴定

分离超声破碎后的菌液上清和沉淀，分别进行SDS-PAGE电泳分析，结果表明目的蛋白主要以包涵体形式进行表达（图6）。

图6 S1蛋白可溶性鉴定结果

Fig.6 Identification of solubility of S1 protein

1：蛋白标准分子量；2：超声破碎后全菌；3：上清；4：沉淀

1: Protein Marker ; 2: The total bacteria protein after crushing ; 3: Supernatant ; 4: Precipitation

2.5 S1蛋白表达条件优化

2.5.1不同诱导时间目的蛋白的表达

SDS-PAGE分析结果显示，诱导表达12小时的目的蛋白表达量要高于6小时（图7）。          

图7 不同诱导时间目的蛋白的表达结果

Fig.7 Expression at different induced time

1：蛋白标准分子量；2：pET28a-S1/BL21诱导表达6小时；3：pET28a-S1/BL21诱导表达12小时

1: Protein Marker ; 2: pET28a-S1/BL21 was induced for 6 hours ; 3: pET28a-S1/BL21 was induced for 6 hours

2.5.2不同诱导剂浓度下目的蛋白的表达

以37℃为诱导温度，不同浓度的IPTG分别诱导12小时，5组不同浓度IPTG诱导后均有目的蛋白表达，除1.5 mmol/L外，在0.2 mmol/L-1.2 mmol/L的浓度范围内，PDCoV S1蛋白的表达量随着IPTG浓度增大而增高（图8）。诱导PDCoV S1蛋白表达的IPTG最佳浓度为1.2 mmol/L。

图8 不同诱导剂浓度下目的蛋白的表达结果

Fig.8 Expression at different IPTG dosages

1：蛋白标准分子量；2：空载体对照；3：0.2 mmol/L IPTG；

4：0.5 mmol/L IPTG；5：1.0 mmol/L IPTG；6：1.2 mmol/L IPTG；7：1.5 mmol/L IPTG

1: Protein Marker ; 2: The blank vector control ; 3: 0.2 mmol/L IPTG ;

4: 0.5 mmol/L IPTG ; 5: 1.0 mmol/L IPTG ; 6: 1.2 mmol/L IPTG ; 7: 1.5 mmol/L IPTG

2.5.3不同诱导温度下目的蛋白的表达

在最佳IPTG浓度和最佳诱导时间下，分别以19℃、37℃诱导目的蛋白表达，SDS-PAGE 结果显示在19℃条件下目的蛋白表达量更多（图9）。

图9 不同诱导温度下目的蛋白的表达结果

Fig.9 Expression at different temperature

1：蛋白标准分子量；2：37℃诱导表达；3：19℃诱导表达

1: Protein Marker ; 2: Expression at 37℃ ; 3: Expression at 19℃

3 结论及讨论

国内的一些流行病学调查结果显示PDCoV在中国大陆的流行已较为普遍，检测率高达30%，对养猪业的威胁不容忽视[6][7][8]。在流行病学调查时发现，PDCoV与其它猪肠道病病原混合感染的现象也较为常见。Marthaler等检测了293个样品，PDCoV的检出率为30% (89/293)，与轮状病毒的混合感染率高达58% (52/89)[9]。吴美洲等人对我国三个省10个猪场的64份样品进行了检测，PDCoV的检测率为23.4%，与PEDV混合感染率为6.4%[10]。PDCoV作为一种新型病原，由于其对养猪业的危害较大，人们越来越重视对PDCoV的研究。

S蛋白位于PDCoV表面，是重要的结构蛋白，抗原位点及变异区主要存在于S1区域，能诱导机体产生相应的中和抗体。大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统，具有遗传背景清楚、培养操作简单、生长繁殖快、成本低廉、表达量高等优点[11]。本研究构建了pET28a-S1重组质粒，并转化至E. coli BL21( DE3)中，经IPTG诱导表达后，成功表达出以包涵体的形式存在的PDCoV S1蛋白，为建立PDCoV间接ELISA检测方法奠定了基础。

参考文献

[1] Chen Q, Gauger P, Stafne M, et al. Pathogenicity and Pathogenesis of a United States Porcine Deltacoronavirus Cell Culture Isolate in 5-Day-Old Neonatal Piglets[J]. Virology, 2015, 482: 51-59.

[2] Wang L Y, Byrum B, Zhang Y. Detection and Genetic Characterization of Deltacoronavirus in Pigs, Ohio, USA, 2014[J]. Emerging Infectious Diseases, 2014, 20(7): 1227-1230. 

[3] WOO P C Y, LAU S K P, LAM C S F, et al. Discovery of seven novel mammalian and avian coronaviruses in the genus Deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source of Alphacoronavirus and Betacoronavirus and avian coronaviruses as the gene source of Gammacoronavirus and Deltacoronavirus[J]. J Virol, 2012, 86(7): 3995–4008.

[4] Wang L Y, Hayes J, Sarver C, et al. Porcine deltacoronavirus: Histological lesions and genetic characterization[J]. Arch Virol, 2016, 161(1): 171–175. 

[5]龙云凤, 王毅谦, 姜珊, 等. 猪δ冠状病毒研究进展[J]. 亚洲兽医病例研究, 2017, 6(2): 21–28.

[6] Song D, Zhou X, Peng Q, et al. Newly Emerged Porcine Deltacoronavirus Associated with Diarrhoea in Swine in China: Identifcation, Prevalence and Full-Length Genome Sequence Analysis[J]. Transboundary and Emerging Diseases, 2015, 62(6): 575-580.

[7] Wang Y W, Yue H, Fang W, et al. Complete Genome Sequence of Porcine Deltacoronavirus Strain CH/Sichuan/S27/2012 from Mainland China[J]. Genome Announcements, 2015, 3(5): e00945-15.

[8] Chen F, Zhu Y, Wu M, et al. Full-Length Genome Characterization of Chinese Porcine Deltacoronavirus Strain CH/SXD1/2015[J]. Genome Announcements, 2015, 3(5): e01284-15.

[9] Marthaler D, Raymond L, Jiang Y, et al. Rapid Detection, Complete Genome Sequencing, and Phylogenetic Analysis of Porcine Deltacoronavirus[J]. Emerging Infectious Diseases, 2014, 20(8): 1347-1350.

[10] 吴美洲, 陈芳洲, 朱银杏, 等. 丁型冠状病毒我国猪源株的遗传变异分析[J]. 中国兽医科学, 2016, 46(6): 689-694.

[11] Nuc P, Nuc K. Recombinant protein production in Escherichia coli [J]. Postepy Biochem, 2006, 52(4): 448-456.