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鸡鼻炎三价灭活疫苗工艺浅谈

来源:文|肖志强 黄骄 张洪发布时间:2018-05-30 点击率:2244

鸡传染性鼻炎是由副鸡禽杆菌引起的急性呼吸道传染病,是一种危害鸡、火鸡和山鸡等家禽和野禽的接触性传染病,可使育成鸡生长发育不良和产蛋鸡产蛋明显下降。该病在世界许多地方都有发生和流行,发病率和死亡率通常在10-30%,多发生于寒冷潮湿的季节。一旦某地区的鸡群发生鸡鼻炎副鸡嗜血杆菌感染,该病就会成为地方性疾病,很难彻底根除,并且经常反复爆发该病,因此给养鸡业造成很大经济损失。

副鸡禽杆菌含有很多株型,根据的Apg血清学分型可将其分为A、B、C三个型。在国内分离出A型菌株的报道最多,其次是C型和B型。三价的灭活疫苗对鸡传染性鼻炎具有更稳定和更广谱的预防作用,因此该疫苗是养殖户预防此病的首选。由于副鸡禽杆菌在宿主体外不易培养和存活,其大规模生产较难,也更需要对该工艺质量严格把控,层层把关。针对于该情况,本文将对生产工艺中质量关键控制点及优化进行阐述,并为生产出安全、高效、稳定的优质疫苗奠定良好基础。

1.培养基选择

副鸡禽杆菌的生长条件较为苛刻,在普通的培养基上难以生长。目前培养副鸡禽杆菌生长的培养基主要有鸡血清鸡肉汤培养基、半合成培养基和胰蛋白胨大豆肉汤培养基等,市场上也有副嗜血杆菌成品培养基。在大规模生产工艺中,成本和培养效果无疑是培养基选择的重要因素。鸡血清鸡肉汤培养基的培养效果是较好的,但其配方中的酵母液、鸡肉汤制备方法复杂繁琐、成本较高且品控不易把握。而半合成培养基效果次于前者,但其培养效果不错且配置简便。因此利用鸡血清鸡肉汤培养基制备种子,而将半合成培养基用于罐体高密度发酵。这样通过鸡血清鸡肉汤培养基对种子优化,可以使后期发酵的质量得以保证。

同样鸡血清和辅酶I也是培养副鸡禽杆菌不可或缺的重要成分。目前发现培养基中的鸡血清和辅酶I用量越足,副鸡禽杆菌的长势越好。但两者成本依然较高,因此种子培养基含10%的鸡血清和0.005% NAD,而上罐培养基中血清和辅酶I分别采用5%和0.002%的用量。

2.菌种质量控制

副鸡禽杆菌非常脆弱,尤其是在宿主体外培养的副鸡禽杆菌,4℃最多保存几天,室温下保存1-2天,37℃不超过1天。种毒在冻干制备过程中也易衰亡,因此采用平皿划线法对复苏的冻干菌种进行优化是十分必要的。挑选在平皿上新长出的典型菌落用于下一级种子传代,菌落直径大小约0.5mm左右为宜。平皿菌落可保存至2-8℃,不宜超过三天。而种子在传代过程中尽量迅速接种传代,低温或常温放置均容易衰亡。

另外在种子液体培养基传代过程中,为保证菌种的活力,可通过测生长曲线和对应的菌液吸光值,找准菌液浓度增长最快的时候进行接种。然而该菌在指数生长期的时间很短,需要细心把控。

3.发酵控制

3.1 接种量  

接种量是影响细菌发酵的重要因素,增大接种量可以明显缩短种子液对培养基的适应过程,从而较快进入对数生长期,缩短延滞期。但增加接种比例也有一定范围,接种量过大时,会过度消耗培养基中的营养成分,同时产生大量的抑制细菌继续增长的代谢产物。同时,较大的接种量也意味着制备种子的工作量的加大。我们通过实验发现,副鸡禽杆菌的培养采用1%的接种比例可提高活菌平台期活菌数目。

3.2 溶氧

副鸡禽杆菌属于兼性厌氧菌,在固体培养基培养时一般需要厌氧环境或5-10%的CO2,液体培养时无须厌氧或CO2环境,但需振荡培养。但不同血清型的副鸡禽杆菌震荡和需氧的条件有一定差异。A型在培养时,可静止培养,而B型和C型静止生长极其缓慢。在副鸡禽杆菌A、B、C型发酵罐通空气培养时,溶氧量和搅拌速度开得越大,其生长的速度越快,但其平台期的活菌浓度并未有很大提高。

3.3 pH

副鸡禽杆菌培养的最适pH在6.9-7.6之间。但发酵后期随着代谢产物以及次级代谢产物的增多,pH可能降至6.5左右,会影响细菌的生长。当培养环境偏酸时,补氢氧化钠调节pH,可显著改善其生长状况。

4.活菌计数

由于副鸡禽杆菌本来脆弱易衰亡,在发酵液进行CFU活菌计数时,常温或低温的稀释液以及固体培养基平皿导致细菌死亡,因此在稀释液平皿使用时,应将其放置37℃预热,另外预热亦可减少由平皿培养基表层水分导致的菌落不能分开生长。

5.浓缩纯化

目前,副鸡禽杆菌主要通过离心的方式进行浓缩,然而副鸡禽杆菌B型培养菌液活菌数已经超过配苗的菌数要求, C型菌液活菌数也接近其配苗标准,因此在考虑成本以及有效抗原损耗的情况下,在以后的工艺优化中可考虑是否取消浓缩,并对纯化工艺进一步改进和验证。

 

参考文献

(略)


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