猪瘟野毒株和疫苗株一步法双重TaqMan-MGB 荧光定量RT-PCR方法的建立

摘要：为了建立一种快速、高效、敏感、特异的猪瘟病毒（CSFV）野毒株和疫苗株（C 株)的鉴别检测方法，根据CSFV基因序列的比对结果，在基因组 5′UTR区设计了1对针对CSFV的通用引物和2条分别针对野毒株和疫苗株（C 株)的特异性MGB 探针,建立了双重TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法。该方法可同时鉴别检测猪瘟野毒株和疫苗株C株，对其他相关猪病的病原检测结果为阴性；构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系，检测野毒株和疫苗株质粒的灵敏性可分别达106copies/μL和902copies/μL，其灵敏度与RT-nPCR相近，比商品化的RT-PCR试剂盒敏感100倍；对4份样品进行4次批内和批间重复检测，变异系数均小于2%；应用该方法对126份屠宰场组织样品的检测结果与RT-nPCR方法一致。建立的猪瘟野毒株和疫苗株一步法双重TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好，可用于猪瘟的流行病学调查，野毒株和疫苗C株的鉴别检测。

关键词：TaqMan-MGB；荧光定量RT-PCR；猪瘟病毒野毒株；C株

猪瘟（classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起猪的高度接触性、致死性传染病，不同年龄、性别和品种的猪均能感染，给世界养猪业造成了巨大威胁和经济损失 ^[1]，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物传染病，我国将其列为一类动物传染病。近年来，一些已宣布消灭CSF的欧洲国家出现了CSF疫情的复发^[2]，2005年至2012年期间，共有46个国家和地区发生了CSF^[3]。总体上，猪瘟在我国得到了有效的控制，但由于多种因素的影响，猪瘟疫苗免疫失败的现象较为普遍^[4-5]，CSF在我国仍然广泛存在，其流行形式也以非典型CSF为主^[6-12]。CSFV在猪群长期存在的原因主要是母猪带毒综合征，开展监测净化是防控CSF的有效手段^[12]。由于疫苗的广泛使用，用抗体检测的方法很难查明猪群内CSF的流行情况；CSFV疫苗株和野毒株鉴别检测方法的建立对CSF的诊断和净化非常重要。传统的CSFV病原学检测方法，如病毒分离^[13]、免疫荧光、ELISA^[14]、RT-PCR等，不同程度的存在敏感性和特异性低，耗时等不足^[15-16]，且不能区分野毒株和疫苗株。目前，已有采用RT-nPCR和荧光RT-PCR方法鉴别CSFV野毒株和C株的报道^[17-20]，但是RT-nPCR容易造成污染，单重荧光RT-PCR不能对CSFV野毒株和疫苗株同时检测，而多重荧光RT-PCR方法大多采用两步法，比较麻烦。本研究采用TaqMan-MGB技术，建立双重一步法荧光定量RT-PCR对CSFV野毒株和疫苗株进行鉴别及定量检测，为CSF的诊断、监测、净化和疫苗质量监控提供了一个种快速、准确的方法。

1 材料和方法

1.1毒株与样品  猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)：A、B、C、D、E疫苗公司生产的猪瘟脾淋疫苗，E疫苗公司生产的猪瘟细胞苗；A型、O型、Asia1型FMDV标准抗原：中国农业科学院兰州兽医研究所生产的口蹄疫抗体液相阻断ELISA试剂盒；高致病性猪蓝耳病弱毒（HPRRSV，JXA1-R株）、猪蓝耳病经典株（PRRSV，CH1-R株）、猪伪狂犬病毒(PRV)：来自商品弱毒疫苗；猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(Shimen株)、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV)：四川农业大学保存；在屠宰环节采集的扁桃体、肺脏、脾脏、淋巴结等病原学监测样品：四川省动物疫病预防控制中心保存。

1.2主要试剂与仪器  PrimeScript one step RT-PCR kit ver.2 RT-PCR一步法扩增试剂盒，One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time) 荧光RT-PCR一步法扩增试剂盒、pMD-20T载体购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，TIAN pure Midi Plasmid Kit质粒提取试剂盒，感受态细胞DH5α购自天根公司；RNA、DNA柱式提取试剂盒购自北京世纪元亨；Y公司生产的猪瘟RT-PCR试剂盒。

iQ^TM5荧光定量PCR仪(BIO-RAD，美国)；凝胶成像系统(BIO-RAD，美国)；普通梯度PCR仪(BIO-RAD，美国)；冷冻离心机(Sigma，德国)；核酸蛋白检测仪(Ependorf Biophotometer，德国)。

1.3引物与探针的设计和合成  用DNAStar软件MegAlign模块对GenBank中登录的26株CSFV、4株BVDV和2株BDV基因组序列进行比对分析，选取高度保守的5`-UTR作为扩增靶区，采用Primer Express 3.0软件设计一对特异性引物、野毒株特异性探针和疫苗株特异性探针（表1），通过Blast比较分析，验证所选基因片段和设计的引物探针具有的高度特异性。对照方法RT-nPCR的引物参照国家猪瘟参考实验室略有改动^[18]。引物和探针由上海基康公司合成；将引物稀释成20μM，再将相应上下游引物等量混合，其终浓度为10μM；探针稀释成10μM。

1.4病毒核酸的提取  使用北京世纪元亨公司RNA柱式提取试剂盒和DNA柱式提取试剂盒提取相应病毒的核酸, 提取步骤按照文献^[21]进行。

1.5标准阳性质粒的构建及鉴定  分别以CSFV (Shimen 株和疫苗C株)RNA为模板，用Primescript one step RT-PCR kit ver.2试剂盒和引物HC1和HC2进行RT-PCR扩增。按照文献^[21]的方法构建标准质粒，将阳性质粒分别命名为PMD-W和PMD-C。

表1 引物和探针的序列和位置

1.6双重荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件优化  先分别将检测CSFV野毒株和疫苗株的单重荧光RT-PCR的引物和探针浓度、退火温度等参数进行优化，再此基础上，再用矩阵法对于该双重荧光定量RT-PCR的退火温度、引物和探针的浓度等进行优化，得到最佳反应条件参数。

1.7双重荧光RT-PCR方法标准曲线的建立及灵敏度检测  用小量质粒提取试剂盒提取阳性质粒，用微量紫外分光光度计测定阳性重组质粒OD₂₆₀值，根据重组质粒的分子量与质量浓度，计算重组质粒拷贝浓度。用10×系列稀释质粒标准品为模板，优化后双重荧光定量RT-PCR方法测定各稀释度的Ct值，每个稀释度分别做2个重复，并设立阴性对照，建立质粒拷贝浓度与Ct值对应的定量标准曲线；通过对不同稀释度标准品的检测确定该方法的灵敏度。

1.8特异性试验  以CSFV疫苗C株（5个公司的脾淋弱毒苗和1个公司的细胞苗）、Shimen株、PRRSV(CH1-R株）、HPRRSV（JXA1-R），JEV、BVDV、FMDV(A型、O型、Asia1型) 、PCV2、PRV、PPV核酸为模板，用双重荧光RT-PCR方法检测，以评价该方法的特异性。

1.9 CSFV野毒株和疫苗株混合模板的检测  将猪瘟野毒株和疫苗株标准质粒样品按照不同的浓度进行组合，进行双重荧光RT-PCR检测，确定二者之间的检测是否存在相互干扰现象。

1.10 双重荧光RT-PCR、常规RT-PCR和RT-nPCR灵敏度比较  分别用双重荧光RT-PCR、常规RT-PCR和RT-nPCR对相同的样品进行检测，比较其灵敏性。

1.10.1检测样品  分别提取1份临床发病猪瘟阳性样品（经测序为猪瘟2.1基因亚型）的RNA，以10×倍比稀释RNA作为扩增模板。

1.10.2常规RT-PCR  用Y公司生产的猪瘟RT-PCR商品试剂盒，严格按照说明书进行。反应体系：取16.8µlRT-PCR反应液，1.2µl酶混合液，2µl模板RNA。循环参数：45℃ 45min、94℃ 3min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min。取RT-PCR扩增产物15µl，用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，条带大小为272bp。

1.10.3 RT-nPCR  RT-nPCR参照国家猪瘟参考实验室所使用的方法略有改动^[18]。第一步用Primescript one step RT-PCR kit ver.2试剂盒和外引物HW1和HW2进行RT-PCR扩增。反应体系：Enzyme Mix 1μL，2x Buffer 12.5μL，引物(HW1和HW2)1.5μL，RNase Free dH2O 7.5μL，RNA模板2.5μL。循环参数：50℃ 30min，94℃ 3min；94℃ 30s、54℃ 30s、72℃70s，30个循环；72℃ 5min，4℃ 保存。第二步反应采用TIANGEN的Premix试剂盒扩增。反应体系：Enzyme Mix 1μL，2x Buffer 12.5μL，内引物（HN1和HN2）1μL，RNase Free dH2O 9.5μL，DNA模板1μL。循环参数：94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 30s，30个循环；72℃ 5min。用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，上样量15µl，条带大小为272bp。

1.11重复性试验  为评价双重荧光RT-PCR方法对CSFV野毒株RNA检测的可重复性，分别对4份CSF RNA样品在同一次反应中进行4次重复测定，计算每个样品各反应管之间的批内变异系数(intra-assay CV%)；对上述样品分别进行4次测定，计算同一样品每次测定结果之间的批间变异系数(inter-assay CV%)。

1.12临床样品的检测  用建立的双重荧光RT-PCR、常规RT-PCR和RT-nPCR分别对来自屠宰场的126份组织样品进行检测，并对阳性样品进行E2基因片段克隆测序鉴定。

2 结果

2.1目的片段的获取及重组质粒的构建  分别以Shimen株和C株的RNA为模板，用RT-PCR均扩增出约117bp左右的特异性片段，扩增条带大小与预期相符；用PCR对克隆的质粒进行鉴定，对质粒的测序结果也证实，目的片段成功克隆到pMD-20T载体中，将其分别命名为PMD-W和PMD-C。(图1)

M：100bp的分子量Marker;1、2：Shimen株和 C 株RNA扩增结果；3阴性对照；4、5：质粒PMD-W和PMD-C扩增结果； 6：pMD-20T对照扩增结果。

图1 RT-PCR扩增产物电泳结果

2.2双重荧光RT-PCR反应条件优化结果  在优化单重荧光RT-PCR反应条件的基础上，确定双重荧光RT-PCR的反应体系为：One step RT-PCR BufferⅢ(2x)12.5 μL、Ex Taq HS(5 U/μL)0.5 μL、RT Enzyme MixⅡ0.5 μL、引物1 μL，WT探针0.4 μL，CT探针0.6 μL，模板2.5 μL，补DEPC水至25 μL。循环参数为：42℃ 5 min，95℃ 10 s；95℃ 10 s，61℃ 35 s，40个循环，61℃延伸结束后收集荧光。

2.3标准曲线的建立及灵敏度测定  PMD-W质粒 OD₂₆₀值为0.664，其拷贝浓度为1.06x10¹⁰ copies/μL；PMD-C质粒 OD₂₆₀值为0.564，其拷贝浓度为9.02 x10⁹ copies/μL。将标准品分别作10×系列稀释，进行双重荧光RT-PCR扩增。检测结果表明，在FAM通道，质粒PMD-W浓度在1.06×10²～8.34×10¹⁰ copies/μL范围内，其浓度的对数与相应Ct值具有明显线性关系；相应标准曲线方程为y = -3.609 ×LOG (copies/μL)+43.141，扩增效率E=89.3%，相关系数 R²=0.998；其检测的极限为1.06×10²copies/μL (图2)。在HEX通道，质粒PMD-C浓度在9.02×10²～9.02×10⁹ copies/μL范围内，其浓度的对数与相应Ct值具有明显线性关系；相应标准曲线方程为y = -3.643 ×LOG (copies/μL)+46.098，扩增效率E=89.2%，相关系数 R²=0.997；其检测极限为9.02×10²copies/μL（图3）。

2.4特异性试验结果  用双重荧光RT-PCR对提取的核酸进行检测，在FAM检测通道（野毒株）只有Shimen株有扩增曲线；在HEX检测通道只有猪瘟疫苗（C株）有扩增曲线；HPRRSV（JXA1-R），PRRSV(CH1-R株）、PCV2、PPV、PRV、JEV、BVDV和FMDV(A型、O型、Asia 1型)在两个检测通道均无扩增曲线。由此可见所建立的双重荧光RT-PC具有良好的特异性（图4）。

2.5双重荧光RT-PCR对混合模板的检测结果 将质粒PMD-W做10×系列稀释，每管同时加2.5μL PMD-C(4.51E+04 copies /μL)和2.5μL 系列稀释的PMD-W作为模板，用双重荧光RT-PCR检测。将质粒PMD-C做10×系列稀释，每管同时加2.5μL PMD-W(5.30E+05copies /μL)和系列稀释的2.5μL PMD-C作为模板，用双重荧光RT-PCR检测。结果表明，双重荧光RT-PCR检测混合模板时相应的RFU值比只检测一种模板时的低，敏感性也相应有所降低；野毒株和疫苗株模板间有一定的干扰。当野毒株模板浓度≥1.06E+07时（两者浓度相差235倍），则会影响了疫苗毒株的检测（图5，表2）；当疫苗毒株模板浓度≥9.02E+08时（两者浓度相差1700倍），则会影响野毒株的检出（图6，表3）。虽然两者有一定的干扰，但其检测敏感度也能达到10³ copies/μL的水平(表2，表3)。

FAM:猪瘟野毒株检测通道；HEX:猪瘟疫苗C株检测通道。

图5 双重荧光RT-PCR检测混合模板试验（干扰试验）1

FAM:猪瘟野毒株检测通道；HEX:猪瘟疫苗C株检测通道。

图6 双重荧光RT-PCR检测混合模板试验（干扰试验）2

表2双重荧光RT-PCR检测混合模板试验结果（干扰试验）1

表3  双重荧光RT-PCR检测混合模板试验结果（干扰试验）2

2.6双重荧光RT-PCR、常规RT-PCR和RT-nPCR的灵敏性比较  提取1份猪瘟病料的RNA（经测序为野毒株），做10×系列稀释，分别用三种方法检测。双重荧光RT-PCR至少可检测到第6个稀释度，RT-nPCR可检测到第6个稀释度，而常规RT-PCR只能检测到第4个稀释度（图6）。由此可见双重荧光RT-PCR与RT-nPCR灵敏性相近，比常规RT-PCR商品试剂盒敏感100倍以上。

2.7重复性测定结果  用本试验建立的双重荧光RT-PCR对4份CSFV病毒RNA的检测结果表明，其批内CV%为0.82%～1.62%（表4），批间CV%为1.23%～1.99%（表5），该检测体系稳定，具有良好的重复性。

表4  双重荧光RT-PCR检测4份样品的批内重复性检测结果

表5  双重荧光RT-PCR检测4份样品的批间重复性检测结果

2.8临床样本的检测  用本实验建立的双重荧光RT-PCR对126屠宰场样品进行了检测，野毒株阳性4份，阳性率3.17%，疫苗株1份，阳性率0.79%；用RT-nPCR检测到阳性5份，阳性率3.97%，经测序确认4份样品为2.1基因亚型，1份为1.1基因亚型（疫苗株）；而常规RT-PCR试剂盒只检测到3份阳性，阳性率2.38%。

3 讨论

CSF传染性强，是危害养猪业最严重的传染病之一，可表现为最急性、急性、慢性和繁殖障碍等多种形式，由于症状的非典型化及其它病原的混合感染，使得CSF的临床诊断越来越困难。我国对CSF的防控采用强制免疫、捕杀和监测净化的政策，大量使用猪瘟兔化弱毒（C株）疫苗进行免疫预防，由于缺乏有效的血清学方法对CSFV的感染抗体和免疫抗体进行鉴别检测，使得野毒感染猪与免疫接种猪难以区分。因此，建立猪瘟野毒株和疫苗株鉴别检测方法对于猪瘟的诊断、净化和防控具有重要的意义。目前，国内外已有几种CSFV野毒和C株鉴别方法的报道。李艳等^[17]针对CSFV强毒株和弱毒株基因组序列的差异，建立了能鉴别CSFV强毒和弱毒的复合RT-nPCR，但在实际应用中，该方法仍存在耗时、易污染、操作也相对繁琐，不能用于病毒定量研究等不足。Zhao等^[19]在CSFV基因组5`-UTR区设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan探针，建立了猪瘟野毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT-PCR检测方法，但将反转录和PCR扩增分步进行，耗时、费力。刘俊等<sup>[18]</sup>在CSFV基因组5`-UTR区设计一对猪瘟病毒通用引物和一条特异性MGB探针，建立了猪瘟病毒野毒株TaqMan-MGB荧光定量PCR鉴别方法，该方法能检测除猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）以外的猪瘟流行野毒株；Liu等^[22]针对CSFV的N^pro 基因区，建立了Tanqman 荧光定量RT-PCR，能特异地检测猪瘟疫苗C株（HCLV 和 Riems疫苗株）；这两个方法均具有很高的敏感性和特异性，但没有实现野毒株和疫苗株的同时检测。本试验针对CSFV基因组5`-UTR区域设计引物和TaqMan-MGB探针，实现了野毒株和疫苗株的双重荧光定量检测。

本研究发现，引物的浓度、退火温度和探针的浓度对目的片段的扩增、扩增曲线的形态和特异性有很大的影响。引物浓度过低影响扩增效率，也会降低RFU值，当引物浓度过高，加样量超过1.5μL时，也会影响其扩增曲线的效果；由于2条探针只相差1个碱基，退火温度对能否鉴别检测猪瘟野毒和疫苗株具有重要影响，退火温度低则猪瘟野毒和疫苗毒有交叉反应，温度过高又影响扩增曲线的效果（RFU值明显降低，扩增曲线不呈典型的S型），双重荧光RT-PCR退火温度为61℃时能得到比较理想的扩增效果。本研究先优化单重荧光RT-PCR的反应条件，再优化双重rRT-PCR的反应条件，获得了最佳扩增效果的反应参数。

本试验建立的猪瘟野毒株和疫苗株一步法双重TaqMan-MGB rRT-PCR检测方法，特异性强，敏感性与RT-nPCR相近，比商品化的RT-PCR试剂盒敏感100倍。当检测混合模板时，高浓度的模板对低浓度的模板有一定的干扰，一种模板的浓度为10⁴～10⁵copys/μL时，其检测另一种模板的灵敏度降低1～2个数量级，即使这样，其敏感性也不低于商品化的RT-PCR试剂盒。相比较而言，检测猪瘟野毒株受疫苗株的影响要小，因此，虽然两者之间存在一定的干扰，但并不影响该方法的应用。究其相互间存在一定干扰的原因，可能是因为设计的引物为野毒和疫苗株的通用引物，其扩增产物对特异性探针与对应模板的结合有一定的竞争干扰，笔者在评价其它病原的MGB荧光定量RT-PCR方法时，也发现存在类似的现象。

参考文献

（略）