禽流感核酸疫苗保存期及稳定性试验

摘要：核酸疫苗是20世纪90年代兴起的一种新型疫苗，因其与传统的疫苗相比能诱导机体产生更全面的保护性免疫，且具有安全、热稳定性、价廉等优点而备受人们的关注。本公司的禽流感核酸疫苗具有良好的免疫保护性，为了便于实际应用，本文对禽流感核酸疫苗在不同温度不同保存时间的稳定性进行了进一步研究。结果显示禽流感核酸疫苗在冻融1-4次、37℃振摇30小时内、25℃保存1个月内、37℃保存10天内均对其质粒含量及超螺旋含量百分比没有影响。

关键词：禽流感核酸疫苗 稳定性

DNA疫苗是防制禽流感最具潜力的基因工程疫苗之一，DNA免疫能够诱导机体产生抗体反应和特异性CTL反应，在克服了灭活疫苗的和普通亚单位疫苗缺点的同时，又避免了重组活载体疫苗免疫反应受母源抗体、循环抗体及细胞免疫记忆干扰的不足及其潜在的突变危险；另外，DNA免疫还具有高度安全稳定、不受宿主种属特性及免疫状态限制、可反复加强免疫以及可在免疫后迅速启动有效而全面的免疫反应记忆效应、免疫持续期长的突出优点。

本公司禽流感核酸疫苗按规程规定保存条件为2-8℃，有效期为12个月，但在实际运输及使用过程中常常无法满足2-8℃保存条件，因此本文设计了4个试验，通过测定禽流感核酸疫苗在不同条件下质粒含量及超螺旋含量百分比的变化，对其稳定性进行了研究。

1 试验材料：

1.1 禽流感核酸疫苗：试验2018001批、2018002批、2018003批。

1.2 主要试剂：PBS液（0.01mol/L，pH值7.2），无菌注射用水，溴化乙锭溶液 (EB)，1×TAE电泳缓冲液，琼脂糖凝胶，1kb DNA Marker，6×Loading buffer。

1.3 仪器：冰箱、培养箱、紫外分光光度计，石英比色皿，电泳仪，电泳槽，紫外凝胶成像仪，各型号移液器以及对应的吸头，0.2ml离心管。

2 试验方法：

2.1  测定方法

2.1.1 质粒含量测定步骤

2.1.1.1  样品的稀释  取待检样品用PBS液稀释50倍。

2.1.1.2  测量  将稀释的待检样品100µl用紫外分光光度计测量其在波长为260nm时的吸光度（OD）值，每个样品重复3次，取平均值。

2.1.1.3  计算  在波长260nm时，OD260值为1的溶液含50μg/ml DNA，故DNA的浓度(mg/ml)=OD260值×50µg/ml×稀释倍数÷1000。 

2.1.2  超螺旋含量百分比测定步骤

2.1.2.1  样品稀释  将待检样品用PBS液稀释至0.01µg/µl。 

2.1.2.2  制胶  准备含有溴化乙锭（10 ng/ml）的琼脂凝胶（0.7%）。

2.1.2.3  电泳液制备  制备溴化乙锭终浓度为10ng/ml的1×TAE电泳缓存液。  

2.1.2.4  电泳 取10µl稀释后的待检验样品，加入2µl 6×loading buffer，混匀后完全注入注样孔内，每个样品做2个重复。在 1×TAE电泳缓冲液中，同样需含有溴化乙锭（10 ng/ml），然后在120V电压下进行电泳45-60分钟左右，至电泳带清晰。

2.1.2.5  结果分析  用凝胶成像仪显现并得到图像，再以相应的分析软件计算出超螺旋构像DNA质粒在总DNA质粒量的百分比。

2.2  试验方法

2.2.1  -20℃反复冻融试验

将3批核酸疫苗，存放在-20℃冰箱。室温自然融化，分别在冻融1次、2次、3次、4次后取样检测质粒含量（mg/ml）和超螺旋质粒百分比（%）。

2.2.2  37℃振摇试验

将3批核酸疫苗，温度控制在37℃。分别在振摇3小时、6小时、9小时、12小时、15小时、18小时、21小时、24小时、30小时后取样检测质粒含量（mg/ml）和超螺旋质粒百分比（%）。

2.2.3  25℃保存试验

将3批核酸疫苗存放在培养箱，温度控制在25℃。分别在存放1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月后取样检测质粒含量（mg/ml）和超螺旋质粒百分比（%）。

2.2.4  37℃保存试验

将3批核酸疫苗存放在培养箱，温度控制在37℃。分别在存放5天、10天、21天、60天、90天后取样检测质粒含量（mg/ml）和超螺旋质粒百分比（%）。

3 结果与分析：

核酸疫苗质粒含量不低于1mg/ml，超螺旋含量百分比不低于80%时判为合格。试验前，3批试验样品的质粒含量及超螺旋含量百分比：

3.1  -20℃反复冻融试验

3.1.1 质粒含量：核酸疫苗试验2018001批、2018002批、2018003批经-20℃冻融1次、2次、3次、4次后质粒含量均变化不大。（如图1）

图1 -20℃反复冻融质粒含量变化

3.1.2 超螺旋含量百分比：核酸疫苗试验2018001批、2018002批、2018003批经-20℃冻融1次、2次、3次、4次后超螺旋含量百分比有部分变化，但均在正常范围内，差异不明显。（如图2）

图2 -20℃反复冻融超螺旋含量百分比变化

3.2  37℃振摇试验

3.2.1 质粒含量：核酸疫苗试验2018001批、2018002批、2018003批振摇3小时、6小时、9小时、12小时、15小时、18小时、21小时、24小时、30小时后质粒含量均变化不大。（如图3）

图3 37℃振摇质粒含量变化

3.2.2 超螺旋含量百分比：核酸疫苗试验2018001批、2018002批、2018003批振摇3小时、6小时、9小时、12小时、15小时、18小时、21小时、24小时、30小时后超螺旋含量百分比有部分变化，但属于正常的范围，差异不明显。（如图4）

图4 37℃振摇超螺旋含量百分比变化

3.3  25℃保存试验

3.3.1 质粒含量：核酸疫苗试验2018001批、2018002批、2018003批25℃存放1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月后质粒含量均变化不大。（如图5）

图5 25℃保存质粒含量变化

3.3.2 超螺旋含量百分比：核酸疫苗试验2018001批、2018002批、2018003批25℃存放1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月超螺旋含量百分比逐步降低，其中试验2018002、2018003批2月时已经低于合格线。（如图6）

图6 25℃保存超螺旋含量百分比变化

3.4  37℃保存试验

3.4.1质粒含量：核酸疫苗试验2018001批、2018002批、2018003批在37℃存放5天、10天、15天、21天、30天后质粒含量均变化不大。（如图7）

图7 37℃保存质粒含量变化

3.4.2 超螺旋含量百分比：核酸疫苗试验2018001批、2018002批、2018003批37℃存放5天、10天、21天、60天、90天超螺旋含量百分比逐步降低，3批样品在15天时已经低于合格线。（如图8）

图8 37℃保存超螺旋含量百分比变化

4 结论：

核酸疫苗在保存时，冻融1-4次、37℃振摇30小时内、25℃保存1月内、37℃保存10天内均对其质粒含量及超螺旋含量百分比没有影响。

参考文献

（略）