鸡新城疫（LaSota株）和禽流感H9亚型（WD株）二联灭活疫苗添加不同剂量的传染性法氏囊病毒VP2蛋白的免疫效果比较

摘要：本试验分别在鸡新城疫（LaSota株）和禽流感H9亚型（WD株）二联灭活疫苗中添加10%、7.5%、5%、2.5%和0%的传染性法氏囊病毒VP2蛋白进行乳化配苗，做安全检验和效力检验。结果，在安全检验中，五组试验动物均健活，无局部和全身不良反应。对安全检验试验动物进行剖检发现，不添加法氏囊蛋白的对照组吸收最好。在效力检验中，免疫后14天、21天各组间新城疫（LaSota株）和禽流感（WD株）抗体无显著性差异（P>0.05）。在免疫后14天、21天分别对各组进行攻毒保护试验，结果不添加组病变率为100%，各添加组的保护率均为100%；对各组攻毒前动物血清法氏囊抗体进行琼扩检测，免疫后14天，各组均有检测不到法氏囊抗体的情况，且法氏囊抗体在23以上的比例不高，免疫后21天，除不添加组外，其余组均能检出法氏囊抗体，其中B组法氏囊抗体在23以上的比例要高于其他低剂量组。

关键词：鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白；不同添加量

鸡传染性法氏囊病（IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的危害雏鸡的一种急性接触性传染病，主要危害3-6周龄的雏鸡。通过感染鸡法氏囊的 B 淋巴细胞，造成感染鸡的免疫功能低下，从而引起免疫抑制。长期的免疫抑制可使鸡群易感染其他疾病，机体对各种疫苗的免疫反应下降，无法正常产生抗体，造成免疫失败，是目前养禽业最重要的疾病之一。 IBDV具有易变异、毒力返强的特点，传统疫苗已不能阻断 IBDV的传播。同时，由于新毒株的不断发现，给 IBDV的防治带来更大的挑战。VP2 蛋白是 IBDV 重要的结构和毒力蛋白，携带宿主保护性抗原决定簇，可以诱导产生中和抗体，并有血清型特异性，因此，研究利用 VP2 蛋白制备疫苗，对防控IBDV 以及开发新型疫苗具有重要意义。

本试验参考车间的配苗方案，通过在鸡新城疫和禽流感二联灭活疫苗中添加不同剂量的IBDV VP2蛋白免疫SPF鸡，通过测定免疫后一定时间的鸡血清NDV、AIV的抗体水平，可以得出添加IBDV VP2蛋白是否会影响NDV和AIV的抗体效价，同时通过琼脂扩散试验测定IBDV的抗体效价，并且在效力检验后进行IBDV攻毒保护试验得出鸡新城疫和禽流感二联灭活疫苗中IBDV VP2蛋白的最佳添加量，在可以有效防控传IBDV感染的同时减少IBDV VP2蛋白的添加量，以期能为车间降低生产成本提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 抗原：配苗用NDV（LaSota株）、AIV（WD株）、传染性法氏囊病毒VP2蛋白由本公司一车间提供。

1.1.2 原料：吐温-80，车间白油和司本-80以94:6比例混合组成的油相由本公司一车间提供，免疫增效剂由公司质检部禽苗组提供。

1.1.3 血清或抗体

鸡新城疫阳性血清：购自中国兽医药品监察所（批号：S121407）；禽流感（H9亚型）阳性血清：本实验室制备（批号：20151019）；法氏囊标准抗体：够自青岛三樱生物技术有限公司（批号：201709）；SPF鸡阴性血清：本实验室制备（批号：20151012）。

1.1.4 抗原

鸡新城（LaSota株）HI抗原：本实验室制备（批号20160105）；禽流感H9亚型（WD株）HI抗原：本实验室制备（批号20160111）；传染性法氏囊病毒VP2蛋白：一车间提供（批号2017003）。

1.1.5 攻毒用法氏囊组织毒：由本实验室用鸡胚繁殖的组织毒（SNJ93 F6）。

1.1.6  主要仪器：实验室高剪切分散乳化机（上海法孚莱能源技术有限公司，型号Type）；TG-16台式高速离心机（四川蜀科仪器有限公司）。

1.1.7  试验动物：25日龄SPF鸡，购自山东济南斯派福瑞，7日龄低免普通鸡。

1.2 方法

1.2.1  疫苗配制

1.2.1.1  水相制备：NDV、AIV按1:1的比例混合，按照IBDV VP2蛋白添加量占水相的比例不同分为五组，其中A组（10%）、B组（7.5%）、C组（5%）、D组（2.5%）为试验组，E组（0%）为对照组，根据水相总体积一致每组加入相应的PBS，然后分别添加相同体积的免疫增效剂，在2800 r/min的低转速下缓慢加入等体积的吐温，让水相混匀。具体各成分的配比如下表1。

表1 新流法乳化各成分配比

1.2.1.3 乳化配苗：在烧杯中加入油相，按油水比3:1的比例，向油相中缓慢加入水相，3400r/min，乳化3分钟，搅拌均匀。然后以6800r/min，乳化11分钟，完成乳化后进行分装。

1.2.2安全检验

1.2.2.1颈部皮下注射：疫苗分别经颈部皮下注射7日龄雏鸡，0.5ml/只，每组10只。接种后14、21天，对接种鸡进行剖检，每次剖5只，观察颈部皮下吸收情况。

1.2.2.2 胸部肌肉注射：疫苗分别经胸部肌肉注射15日龄雏鸡，0.5ml/只，每组10只。接种后14、21天，对接种鸡进行剖检，每次剖5只，观察胸部肌肉吸收情况。

1.2.3效力检验

    按照药典中新流二联灭活疫苗中禽流感部分的效力检验方法，选取3-5周龄的SPF鸡，经胸部肌肉注射本疫苗，0.3ml/只，10只/组。分别于免后14、21天采血，用血凝抑制试验测定血清NDV（LaSota株）、AIV（WD株）的抗体效价，用琼脂扩散试验测定血清中IBDV的抗体效价，并且分别在14、21天采血后，每组随机选取五只，攻IBDV SNJ-93株F6代组织毒，0.1ml点眼+0.1ml滴鼻，连续观察3天，观察动物的死亡情况，在攻毒3天后对攻毒鸡进行剖检，观察法氏囊的病变情况进行结果统计。

1 结果

2.1 安全检验及吸收性试验结果

2.2.1 颈部皮下注射吸收情况（表2，图1）（评分见表3）

表2 颈部皮下注射吸收情况

图1 颈部皮下注射吸收评分参考实图

表3 颈部皮下注射吸收评分标准

由参考评分标准可以得出评分越高，吸收效果越差。由表2可以得出，21天普遍比14天吸收效果好，其中E组吸收效果最好，21天后基本吸收完全，仅见少量散在的点状颗粒物质。

2.1.2 肌肉注射吸收情况（表4，图2）（评分见表5）

表4 安全性及吸收情况得分结果

图2 胸部肌肉注射吸收评分实图

表5 胸部肌肉注射吸收评分标准

整体来看，E组吸收效果最好，21天后基本吸收完全，仅见少量散在的点状颗粒物质，而E组为不添加法氏囊蛋白组，可见添加法氏囊蛋白会影响灭活苗的吸收效果。

2.2血清新城疫和禽流感抗体效价检测结果见表6

表6 各组免疫后不同时间段新城疫和禽流感抗体效价

注：表中同列相同字母表示差异不显著P>0.05，不同字母表示差异显著P<0.05

运用SPSS19.0软件经单因素方差分析，不同IBDV蛋白添加量灭活苗免疫后14、21天各组间鸡新城疫（LaSota株）抗体和禽流感（WD株）抗体不存在显著性差异（P>0.05）。

2.3 各组14、21天采血后法琼扩效价及攻毒保护结果如下表7

表7 各组14、21天采血后IBDV抗体效价及攻毒保护结果

表6 各组免疫后不同时间段新城疫和禽流感抗体效价

注：表中同列相同字母表示差异不显著P>0.05，不同字母表示差异显著P<0.05

运用SPSS19.0软件经单因素方差分析，不同IBDV蛋白添加量灭活苗免疫后14、21天各组间鸡新城疫（LaSota株）抗体和禽流感（WD株）抗体不存在显著性差异（P>0.05）。

2.3 各组14、21天采血后法琼扩效价及攻毒保护结果如下表7

表7 各组14、21天采血后IBDV抗体效价及攻毒保护结果