口蹄疫O型病毒样颗粒疫苗重组蛋白的破碎工艺研究

摘要：重组蛋白在大肠杆菌内可溶性表达，使用高压均质机对表达口蹄疫O型VP1、VP3、VP0结构蛋白的大肠杆菌进行破碎。对比不同均质压力、均质次数，通过革兰氏染色观察菌体破碎情况判断不同条件下对菌体的破碎完成程度，并将破碎后菌液与超声破碎后菌液离心纯化，测定纯化后蛋白浓度，SDS-PAGE观察条带大小及均一性，以选择出适合口蹄疫O型病毒样颗粒疫苗菌体破碎的最佳破碎方案。结果确定：最佳菌体破碎条件是均质压力为800bar、破碎次数为2个循环。

关键词：O型口蹄疫；病毒样颗粒疫苗；高压均质；菌体破碎

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）FMD是由FMDV引起的急性、高接触传染性和快速远距离传播的动物疫病，其感染宿主和传播对象有猪、牛、羊等畜种及野生动物，多达100多种，因为受影响的动物数量巨大，虽然死亡率低，但是疫情的暴发与病毒的流行在全球范围内造成的影响仍是巨大的[1]。该病在我国被列为一类动物疫病，对养殖业危害严重，我国对口蹄疫的防控策略是强制免疫加扑杀，强制免疫使用疫苗主要有口蹄疫全病毒灭活疫苗和合成肽疫苗，分子生物学及基因工程学的发展为口蹄疫新型疫苗的研制提供了研究方向，病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs）作为一种亚单位新型疫苗具有安全性高、免疫原性好、副反应小等优势，在未来可能代替传统FMD疫苗，其开发与问世为FMD的防控带来了新的契机，为我国FMD O型的净化带来可能性[2]。

以大肠杆菌为表达载体的原核表达系统最常使用[3-4]，大肠杆菌作为表达载体具有高效、低成本等特点，被广泛地运用于生物医疗领域。结构蛋白在大肠杆菌内可溶性地表达，菌体细胞破碎后释放胞内的可溶性蛋白，有利于后续纯化与组装。本文以表达口蹄疫O型病毒VP0、VP1、VP3结构蛋白的大肠杆菌BL21（pSMK/O/VP0/VP1/VP3）达菌株[5]的高密度发酵为基础，进行了高压均质破碎条件的摸索，以选择出适合口蹄疫O型VLPs疫苗菌体破碎的最佳破碎方案，为口蹄疫O型VLPs疫苗的产业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株 

工程菌为同时表达口蹄疫O型VP0、VP1与VP3结构蛋白的重组大肠杆菌（pSMK/O/VP0/VP1/VP3），由华派生物工程集团有限公司提供。

1.2 主要试剂  

Buffer A（NaH2PO4  17.6mM；Na2HPO4  2.4mM；NaCl 500mM；pH7.5）；Blue Plus® Ⅱ Protein Marker（14kDa-120kDa），购自北京全式金生物技术有限公司；镍亲和层析填料（Ni SepharoseTM 6 Fast Flow），购自GE Healthcare；其余试剂均为国产分析纯试剂；PierceTM BCA Protein Assay Kit，购自Thermo Scientific。

1.3 主要仪器设备

低温超高压连续流破碎机（JN-30C），购自广东聚能生物科技有限公司；Mini-PROTEAN® Tetra（SDS-PAGE）电泳槽，购自美国BIO-RAD公司；PowerPac电泳仪，购自美国BIO-RAD公司；高速冷冻离心机（TGL16-LA），湖南星科科学仪器有限公司；光学显微镜（奥林巴斯CX23），购自上海启步生物科技有限公司；全功能酶标检测仪（型号：Elx800），购自Biotek Instruments Inc；紫外可见分光光度计（765），购自上海仪电分析仪器有限公司。

1.4 工程菌菌体高压均质破碎

取工程菌的高密度发酵产物，高速冷冻离心机9600 rpm 离心20min，离心后秤取3份菌泥，每份100g，分别用2L Buffer A重悬。低温高压连续流细胞破碎机进行破碎，破碎压力分别为600bar、800bar、1000bar，每个压力对应破碎次数为1次、2次、3次（其分组情况见表1），每个破碎条件操作完成后取样，抹片，革兰氏染色镜检，观察破碎情况，选择5个视野进行观察，5个视野均未发现有完整的成形的菌体即工程菌破碎完全，选择恰好能将菌体破碎完全的压力和次数作为该工程菌的破碎条件。

低温高压连续流细胞破碎机破碎菌糜的操作流程如下：（1）首先打开恒温槽（冷却至4℃左右）冷却过液流路；（2）用适量注射用水清洗各处流路，并且排出管路内气体；（3）加入工程菌悬液，分别设置压力为600bar、800bar、1000bar进行工程菌的破碎。当流出液有菌液流出后，开始回收菌液，待菌液快放完时用1L Buffer进行冲洗；（4）将第1次破碎菌体加入装液斗内进行第2次破碎，待装液斗内菌液快放空时用1L Buffer A进行冲洗，第2次破碎完成，依次完成第3次破碎；（5）每个压力每次破碎完成后取样，破碎菌液抹片，革兰氏染色镜检（10×100），观察菌体的破碎情况。

表1 不同高压均质压力及对应次数对工程菌菌体的破碎分组情况

1.5 高压均质破碎菌体对蛋白浓度和完整性的影响

1.5.1 低温超声破碎  取1g菌糜用20ml Buffer A重悬，于冰浴中超声破碎，破碎条件为3s/3s超声破碎20min[6]，该超声条件下菌体破碎完全。

1.5.2 蛋白纯化与检测  取高压均质破碎后菌液和超声破碎后菌液各20ml，4℃ 12000rpm离心15min，离心后分别取上清进行镍亲和层析纯化（根据GE公司提供的镍亲和层析条件进行蛋白纯化），用BCA法测定纯化后蛋白浓度，SDS-PAGE电泳观察结构蛋白条带大小与均一性，比较两种破碎方法对重组蛋白的得率及完整性的影响。 

2 结果

2.1 工程菌菌体破碎条件

工程菌大肠杆菌（pSMK/O/VP0/VP1/VP3）镜检为两端钝圆、中等大小、结构完整的革兰氏阴性杆菌（图1）。破碎后镜检结果显示，600-1000bar破碎1次、2次、3次均可破碎菌体，菌体破碎完成程度情况随着压力和破碎次数的增加而增加直至菌体破碎完全，800bar 和1000bar 2次能完全破碎菌体（图2），因此将800bar对菌糜破碎2次作为本研究中工程菌菌体破碎条件。

图1 工程菌（革兰氏染色，10×100）

Fig.1 Engineering bacteria（Gram stain, 10×100） 

图2 不同条件破碎的工程菌（革兰氏染色，10×100）

1：600 bar破碎1次；2：600 bar破碎2次；3：600 bar破碎3次；4：800 bar破碎1次；5：800 bar破碎2次；6：800 bar破碎3次；7：1000 bar破碎1次；8：1000 bar破碎2次；9：1000 bar破碎3次；

Fig.2 Engineering bacteria broken in different conditions（Gram stain, 10×100）

1：Breaking for the first time by 600bar；2：Breaking for the second time by 600bar；

3：Breaking for the third time by 800bar；4：Breaking for the first time by 800bar；

5：Breaking for the second time by 800bar；6：Breaking for the third time by 800bar；

7：Breaking for the first time by 1000bar；8：Breaking for the second time by 1000bar；9：Breaking for the third time by 1000bar；

2.2 高压均质破碎菌体对蛋白浓度和完整性的影响

 高压低温破碎和低温超声破碎镍亲和层析纯化后重组蛋白的浓度分别为482.2μg/ml和514.8μg/ml，无显著差异。SDS-PAGE电泳结果显示高压低温破碎和低温超声破碎镍亲和层析纯化后均于45kDa、35kDa、36kDa出现特异性条带，且3个蛋白表达均一（图3、图4），该菌体破碎条件下对结构蛋白影响不大，适用于产业化生产。

图3 SDS-PAGE分析高压均质破碎工程菌纯化后蛋白

1：上样液；2：流川液；3：洗杂液-1；4：洗杂液-2；5：洗脱液-1；6：洗脱液-2；7：洗脱液-3；8：洗脱液-4；M：Protein marker Ⅱ

Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified protein after Low-temperature high-pressure crushing

1：supernatant；2：Flow-through；3：Wash-1；4：Wash-2；5：Elution-1；5：Elution-1；6：Elution-2；7：Elution-3；8：Elution-4；

图4 SDS-PAGE分析超声破碎工程菌纯化后蛋白

1：上样液；2：流川液；3：洗杂液-1；4：洗杂液-2；5：洗脱液-1；6：洗脱液-2；7：洗脱液-3；8：洗脱液-4；M：Protein marker Ⅱ

Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified protein after ultrasonic disruption

1：supernatant；2：Flow-through；3：Wash-1；4：Wash-2；5：Elution-1；5：Elution-1；6：Elution-2；7：Elution-3；8：Elution-4；

3 讨论

蛋白纯化与组装是生物工程下游工艺中产品生产和质量控制的关键点，菌体内可溶性蛋白的释放是蛋白纯化组装的前提与基础。常用的实验室细胞破碎方式有超声破碎、珠磨等破碎方式，实验室级破碎方式显然不适用于规模化生产，中试生产及规模化生产中菌体的破碎通常采用低温超高压连续流细胞破碎机[7]。针对不同物质及不同的生产工艺，其破碎条件有一定的差异，寻找一种有效的破碎条件是保证蛋白活性和高回收率的基础[8]。1971年，Hetherington等开发使用高压匀浆破碎方式对高密度的细胞或微生物进行有效的破碎，该方法能针对大量的菌糜进行破碎[9]。低温高压破碎工程菌主要是利用泵循环产生的高压爆破及剪切力，在破碎过程中的产热主要来源于压差形成的爆破，压差过大会造成产热增加，不利于重组蛋白的回收，影响重组蛋白的活性，因此选择合适的破碎压力和破碎次数是保证蛋白活性和蛋白完全释放的前提。吴蕾等利用低温高压破碎机对大肠杆菌进行破碎，研究表明，随着压力的增加细胞的破碎率随着增加，当压力大于1000bar后随着压力的增加，破碎率保持平稳[10]。利用高压均质破碎工程菌，整个过程中蛋白的活性损伤减小，使用时间短，处理样品量大，适用于生产工艺的放大。本实验采用广东聚能生物的低温超高压连续细胞破碎机，在破碎工程菌过程中温度保持在2-8 ℃，最佳菌体破碎条件是均质压力为800bar、破碎次数为2个循环，能保证将菌体破碎完全，蛋白释放完全，同时对蛋白的活性和回收率影响最小。

参考文献（略）