表达兔病毒性出血症病毒样颗粒的重组杆状病毒HP-VP60的构建及对家兔的免疫效果评价
来源:文|于作,田丽梅,古静,何周凤,蒋琴,方鹏飞发布时间:2019-11-17 点击率:2518
兔出血症(RHD)俗称兔瘟,是由兔出血症病毒(RHDV)引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,给我国养兔业造成巨大的经济损失。RHDV属杯状病毒科,病毒粒子呈球形,直径32-36nm,为二十面体对称,无囊膜。病毒基因组为单链正股RNA,全长约7.4kb。RHDV基因组含有2个开放阅读框,ORF1编码一个分子量约257KDa的多聚蛋白,而后裂解加工成病毒主要结构蛋白VP60与非结构蛋白。VP60蛋白是病毒的免疫保护性抗原,在诱导抗病毒感染的免疫反应中起重要作用。
本研究利用Bac-to-Bac系统构建了表达RHDV LQ株VP60蛋白的重组杆状病毒HP-VP60,对其表达产物血凝效价及免疫原性等进行鉴定,结果显示该重组杆状病毒HP-VP60的表达产物具有良好的免疫原性,可以用于制备RHDV亚单位疫苗。
1 材料与方法
1.1质粒、菌种和细胞
pT-VP60质粒(含有RHDV LQ株VP60基因)由华派生物质检研发中心构建;pFastBac Dual杆状病毒转移载体、DH10Bac感受态细胞和Sf9细胞由华派生物质检研发中心保存。
1.2主要试剂
HRP标记的羊抗兔IgG抗体、FITC标记的羊抗兔IgG抗体购自Sigma公司;转染试剂Lipofectamine 2000购于Thermo Fisher公司;SF-SFM培养基购自苏州市沃美生物技术有限公司;
1.3引物的设计与合成 本文引物序列见下表(表1),由上海英潍捷基有限公司合成。
1.4 VP60基因的扩增与克隆
分别用VP60F1/VP60R1引物和VP60F2/VP60R2引物,以pT-VP60质粒为模板进行PCR,扩增出VP60/EH和VP60/KN基因片段并克隆入pMD19-T载体上,经菌落PCR及相应酶切鉴定后,将阳性质粒送上海英潍捷基有限公司测序,鉴定正确的质粒命名为pT-VP60/EH和pT-VP60/KN。
1.5 重组杆粒Bac-VP60的构建
用EcoRI和HindIII双酶切pFastBac Dual和pT-VP60/EH质粒,将VP60基因克隆入pFastBac Dual载体上,构建重组质粒pFastBac Dual-VP60。然后再通过NheI和KpnI双酶切将VP60基因克隆入pFastBac Dual-VP60上,得到的重组质粒命名为pFastBac Dual-2VP60。将pFastBac Dual-2VP60质粒转化DH10Bac感受态细胞,涂布LB-Bac平板(含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环霉素、100μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG),37℃培养48h。挑取白色单菌落,重新划线LB-Bac平板,37℃培养24h后,再挑取白色单菌落接种于LB-Bac液体培养基(含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环霉素),37℃振荡培养过夜。提取重组杆粒分别用M13F/M13R引物进行PCR鉴定,鉴定正确的重组杆粒命名为Bac-VP60。
1.6重组杆状病毒HP-VP60的获得及传代
参照转染试剂Lipofectamine 2000说明书,将重组杆粒Bac-VP60转染Sf9细胞,转染后每日观察细胞形态,待细胞出现直径变大、产生泡状物、脱落等明显病变后收获细胞培养物,500g/min离心5min,收获上清即为重组杆状病毒母液(F0代病毒),命名为HP-VP60。将F0代病毒液以1%体积比接种Sf9细胞,接毒后72~96小时收获细胞培养物,500g/min离心5分钟收获上清,即为F1代病毒,分装后短期内4℃避光保存,长期应于-70℃保存。
1.7 重组杆状病毒HP-VP60的鉴定
提取重组杆状病毒HP-VP60基因组DNA,用VP60F1和VP60R1引物进行PCR反应,反应体系为:基因组DNA 2.5µl,10×Ex Taq Buffer 5µl,10mM dNTP 2.5µl,Ex Taq 1µl,上下游引物各1µl,ddH2O 37µl。反应程序为:93℃,3min;94℃,45s;55℃,45s;72℃,2min,30个循环;72℃,10min。
1.8 IFA检测重组杆状病毒表达产物
在96孔细胞培养板上,将F1代重组杆状病毒HP-VP60接种对数生长期的Sf9细胞,培养至产生病变时进行IFA检测,同时设未接毒的正常Sf9 细胞作对照。以兔RHDV高免血清(1:50倍稀释)为一抗,FITC-山羊抗兔IgG(1:100倍稀释)为二抗。
1.9 Western Blot检测重组杆状病毒表达产物
将收获的F1代病毒液感染Sf9细胞,72小时后收获上清进行SDS-PAGE电泳,同时使用感染非重组野生型杆状病毒的Sf9细胞以及未被感染重组杆状病毒的Sf9细胞作为阴性对照和空白对照。然后转印至醋酸纤维素膜(NC膜),进行Western Blot检测。
2.0 电镜观察
将收获的病毒液进行蔗糖密度梯度超速离心,取纯化的病毒样颗粒,用2%磷钨酸钠溶液负染,进行电镜观察。
2.1 表达蛋白的血凝效价测定
在96孔“V”形血凝板中每孔先加入50μl灭菌生理盐水,然后在第1孔内分别加入50μl感染重组病毒的细胞培养物,混匀后,吸取50μl加入到第二孔中,如此连续稀释至第11孔,第11孔吸取50μl 液体弃掉;第12孔为灭菌生理盐水对照,阴性细胞培养物按相同方法稀释。然后每孔加入50μl 1%的人“O”型红细胞悬液混匀后,37℃作用30min后观察结果。
2.2 表达蛋白的免疫原性
将收获的病毒液上清,经二乙烯亚胺(BEI)灭活后,制备氢氧化铝胶灭活疫苗。接种1.5~3.0kg健康易感家兔10只,每只颈部皮下注射0.5ml,14日后,将10只免疫兔与10只同条件、同来源的对照兔,每只颈部皮下注射1:9稀释的兔病毒性出血症病毒(肝、脾毒)1.0ml,攻毒后连续观察7日,记录家兔死亡情况。
2结果与分析
2.1 重组杆状病毒HP-VP60鉴定
PCR结果显示得到一条1740bp电泳条带(图1),与目的基因大小一致,说明VP60基因已经整合入重组杆状病毒基因组中。
图1 PCR鉴定重组杆状病毒HP-VP60的凝胶电泳结果
M:DL2000 DNA Marker;1:VP60基因
2.2 重组杆状病毒HP-VP60表达产物的IFA鉴定
IFA鉴定结果显示,感染重组杆状病毒的细胞具有很强的特异性荧光,而作为阴性对照的正常Sf9昆虫细胞无特异性荧光出现(图2),说明VP60蛋白得到表达。
图2 IFA检测VP60蛋白的表达
A:重组杆状病毒HP-VP60感染Sf9细胞(200×);B:Sf9细胞(200×)
2.3 重组杆状病毒HP-VP60表达产物的Western Blot鉴定
Western Blot结果显示在60kDa处出现明显的目的蛋白条带,而感染非重组野生型杆状病毒的Sf9细胞悬液和正常Sf9细胞悬液无条带(图3),说明VP60蛋白在Sf9细胞中成功表达。
M:预染蛋白Marker;1:感染重组杆状病毒HP-VP60的Sf9细胞悬液;
2:感染非重组野生型杆状病毒的Sf9细胞悬液;3:正常Sf9细胞悬液
2.4 电镜检测
电镜下可见大小约为35-40nm的病毒样颗粒,与RHDV病毒粒子大小相当、形态学相近(图4)。
图4 纯化后的病毒样颗粒电镜照片
2.5 表达蛋白的血凝效价测定
血凝试验结果显示,重组杆状病毒HP-VP60的表达产物能凝集人的“O”型红细胞悬液,血凝效价为1:4096。
2.6 免疫原性试验
将收获的病毒液上清灭活,制备氢氧化铝胶灭活疫苗,进行家兔攻毒保护试验。结果显示免疫组家兔100%保护,对照组家兔全部死亡(表2)。
3 讨论
昆虫杆状病毒表达系统表达效率高,表达的蛋白抗原性、免疫原性均与天然蛋白相似,生物活性较高,而且可以实现全悬浮培养,利用该系统表达外源蛋白,经济、高效;本研究利用昆虫杆状病毒Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒HP-VP60,用该重组杆状病毒感染Sf9细胞后能够表达出VP60蛋白,其在细胞内能自动组装成VLP。将表达出的VLP制备成疫苗后免疫家兔,能够100%保护家兔免受强毒攻击。本研究为制备RHDV亚单位疫苗奠定了基础。