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3株猪塞内卡病毒的分离鉴定

来源:文/贺大芳 邱文英 张丽燕 陈奕帆 孙继海 胥燕芳发布时间:2020-05-15 点击率:2367

摘要:试验从广东、广西等地猪场送检的10份疑似猪塞内卡病的病料中成功分离出了3株病毒,分别命名为SVA-HN16、SVA-HN16/1、SVA-HN16/2株。将分离到的病毒进行测序鉴定、病毒的纯化培养、动物致病性试验、免疫原性试验等,结果表明分别3株病毒均是猪塞内卡病毒,均能在PK15-HN细胞上增殖,其中SVA-HN16毒株病毒含量大于其它2个毒株。动物致病性试验表明,HN16毒株可引起试验猪5/5全部发病,并出现典型临床症状,致病性最强。将分离到的病毒株制备灭活疫苗进行免疫原性试验,HN16毒株疫苗可取得5/5的有效保护。因此拟用HN16毒株作为猪塞内卡病灭活疫苗的候选毒株,并将其命名为HN16株。

关键词:塞内卡谷病毒;流行病学; 分离鉴定

塞内卡病毒(Seneca Valley virus,SVA)是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)Senecavirus病毒属的典型代表,与心病毒属(Cardiovirus)最接近,可以引起猪皮肤产生水疱症状,其感染后与猪口蹄疫、猪水疱病、水疱性口炎和水疱性疹的临床症状十分相似,主要通过感染仔猪使其猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、溃烂创面从而导致跛足甚至死亡。

关于SVA 感染所致猪水疱病报道自2015年来显著增多,SVA的许多特征也得到了鉴定。SVA感染动物是重要的传染源,其能通过多种途径排出塞内卡病毒,如唾液、粪便、水疱皮等,在康复的动物组织也能检测到SVA的核糖核酸。SVA能够适应不同的细胞系,可利用猪睾丸细胞(SK-RST)、猪肾细胞(PK-15)、人肺癌细胞(NCI-H1299)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21)等细胞系对SVA进行分离。但目前关于塞内卡病仍没有特效治疗方法。因此,掌握塞内卡病的流行趋势,研究其流行病学,并研制出相应的疫苗和诊断试剂来预防和诊断塞内卡谷病具有非常重大的意义。选择免疫原性好、抗原谱广、遗传性能稳定且对试验动物和制苗材料具有良好适应性的制苗毒种是疫苗研制和免疫成败的关键。

本试验对收集保存的我国塞内卡谷病毒流行毒株进行了分析研究,筛选出了猪塞内卡病灭活疫苗制苗毒种。试验从广东等地猪场送检的10份疑似SVA的病料中成功分离出了3株病毒,PCR检测、基因测序和致病性试验显示3株病毒均属于猪塞内卡病毒,分别命名为SVA-HN16、SVA-HN16/1、SVA-HN16/2。3株病毒均能适应在PK15-HN细胞上增殖,而SVA-HN16毒株病毒含量大于其它2个毒株。动物致病性试验表明,SVA-HN16毒株可引起试验猪5/5发病,并出现典型临床症状,致病性最强。将病毒制备灭活疫苗进行免疫原性试验,SVA-HN16毒株疫苗可取得5/5的有效保护;因此拟用SVA-HN16毒株作为猪塞内卡病灭活疫苗的候选毒株,并将其命名为HN16株。

1 材料  

1.1 病料  来自广东等地猪场,病猪的主要症状为蹄部和鼻镜出现水疱、跛脚、喜卧等,采集猪水疱皮,-70℃以下保存备用。

1.2 细胞  PK15-HN细胞,由华派生物工程集团有限公司保管及供应。

1.3 培养基  Gibco™ MEM培养基、Gibco ®胎牛血清,购自Gibco公司。

1.4 试验动物  28~35日龄、56~63日龄健康易感仔猪(猪塞内卡病毒血清中和抗体效价不高于1:4,猪塞内卡病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫病毒抗原阴性),购自定点猪场。

1.5 试剂  Mastermixture试剂盒,购自天根生化科技有限公司;RNA抽提试剂盒,购自QIAGEN公司;RT-PCR试剂盒,购自宝生物公司。

2 方法

2.1 病料处理  分别取疑似猪塞内卡病的病料(猪水疱皮),称重,按照1:3(W/V)加入灭菌的PBS(0.01mol/L,pH 7.2)进行研磨,按总体积1/100的比例加入青霉素和链霉素,-20℃反复冻融3次,12000 r/min离心5分钟,取上清,用孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤除菌,分装后-70°C以下保存待用。  

2.2 PCR检测  按RNA抽提试剂盒说明书提取上清中的RNA。根据 GenBank收录的猪塞内卡病毒全基因序列设计一对扩增猪塞内卡病毒VP1基因的特异性引物,引物序列为:

上游引物:5’- ATGGTTGGTTTAGCCTGCACAAG -3’;

下游引物:5’- AAGCACGGATGAGACAGAGTTCCAA -3’;

使用特异性引物对2.1中处理好的样品进行PCR鉴定,RT-PCR扩增程序为:反转录42°C 50min;以反转录产物为模板,94°C 4min ,94°C 60s,58°C 60s,72°C 60s,共30个循环;72°C 5min。PCR产物进行1.5%凝胶电泳鉴定。

2.3 病毒分离培养

2.3.1 取已长至致密单层的PK15-HN,用0.25%胰酶在37°C左右消化3~5 min,并用含10%新生牛血清的MEM细胞生长液制成浓度约为2×105个/ml的细胞悬液,分别按2ml/孔加入6孔板中,轻轻摇匀。37°C、5% CO2培养箱中培养18~24小时至90%细胞长成单层。

2.3.2 取2.2中出现特异性条带的病料处理液0.15ml,沿孔壁分别接种于2.3.1的细胞中,37°C吸附1 h,加入含2%新生牛血清的MEM维持液, 37°C、5% CO2培养箱中培养24~48小时,收获细胞培养物,于-20°C冰箱中暂时保存(长期保存需放置于-70°C以下)。

2.3.3 将2.3.2中收获的细胞培养物接种PK15-HN细胞单层,进行盲传,收获的每一代细胞培养物均置-70°C以下保存。同时,传代过程中,观察每代细胞在接种后是否出现特征性细胞病变。如盲传5代无特征性细胞病变,则弃之。

2.3.4 PCR检测细胞培养物,检测结果为猪塞内卡病毒阳性则进行纯净性检测和病毒鉴定。

2.4 分子生物学鉴定

2.4.1 PCR法扩增  按2.2中的方法提取细胞培养物RNA,并对其进行RT-PCR鉴定。

2.4.2 病毒含量测定  用含2%血清的MEM 培养液将毒种作10倍系列稀释,取10-2、10-3、10-4、10-5 4个稀释度病毒液,每孔100μl接种于已生长良好的PK15-HN单层细胞的96孔培养板,每个稀释度接种8孔,同时设正常细胞对照,置37°C、5% CO2培养箱中培养72~96小时,观察细胞病变(CPE)。按Reed-Muench法计算TCID50。

2.5 纯净性检验

2.5.1 无菌检验  按现行《中国兽药典》附录方法进行无菌检测。

2.5.2 支原体检验  按现行《中国兽药典》附录方法进行支原体检测。

2.5.3 外源病毒检验  按现行《现行中国兽药典》附录进行外源病毒检测。

2.6 动物致病性试验  选择PK15-HN细胞上传代至F6代时病毒含量≥106.0TCID50/ml的毒株进行动物致病性试验。取56~63日龄健康易感仔猪15头,随机分2组,每组5头。分组经后海穴注射病毒株2.0ml/头(106.0TCID50/ml)。攻毒后各组均隔离饲养,并连续观察7日。如有发病猪,采集发病猪的水疱皮,加50%甘油PBS(pH7.2),-70°C保存。

2.7 免疫原性试验  使用终浓度为2‰的甲醛溶液对3株病毒毒株进行灭活,灭活完全后乳化配苗。取28~35日龄健康易感仔猪20头,随机分为4组,每组5头。第1~3组为试验组,分组经颈部肌肉接种制备的灭活疫苗2.0ml/头;第4组为对照组,每头接种相同剂量生理盐水。免疫14日后试验组及对照组按相同剂量和途径加强免疫一次。二免14日后采血进行中和抗体效价测定以及攻毒试验。以2.6中毒力最强的一株病毒作为攻毒毒株,对试验组和对照组进行后海穴注射攻毒2.0ml(含106.0TCID50)。攻毒后各组均隔离饲养,并连续观察7日,记录发病情况,计算各试验组的保护率。

3 结果  

3.1 病料PCR检测  将10份临床诊断疑似SVA的猪水疱皮经青霉素和链霉素处理后提取RNA,经RT-PCR反应,PCR产物进行凝胶电泳鉴定,结果显示有3份病料为猪塞内卡病毒阳性。将此3份阳性样品接种PK15-HN细胞,盲传3代后进行RT-PCR检测,其中3份样品均呈SVA阳性,电泳结果见图1。将1号样品分离毒株命名为:SVA-HN16;2号样品分离毒株命名为:SVA-HN16/1;3号样品分离毒株命名为:SVA-HN16/2。

 

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图1  3份阳性样品电泳图

1~3: 传代后RT-PCR检测样品;-: 阴性对照、空白对照;

M: DNA Marker DL2000

3.2 纯净性

3.2.1 无菌检验  按现行《中国兽药典》规定的检测,3株毒株的细胞培养物均无细菌生长,结果见表1。

3.2.2 支原体检验  3株毒株的细胞培养物均无支原体污染,结果见表1。

3.2.3 外源病毒检验  3株毒株的细胞培养物均无由外源病毒所致的特异性荧光、致红细胞吸附以及红细胞吸附现象。

表1 3株分离毒株的纯净性检测结果

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注:“Y”为检测合格;“N”为检测不合格

3.3 病毒含量测定  对SVA-HN16、SVA-HN16/1和SVA-HN16/2 3株猪塞内卡病毒在PK15-HN细胞上培养增殖的F2、F4及F6代进行病毒含量测定,测定结果见表2。HN16株F2、F4及F6代的病毒含量均为最高;SVA-HN16/1株含量最低,培养至F6代,病毒滴度仍低于105.5 TCID50/ml,因此只选择SVA-HN16、SVA-HN16/2。

表2 4株分离毒株不同代次病毒含量测定

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3.4 动物致病性试验  将2株分离病毒接种56~63日龄健康易感仔猪进行动物致病性试验。攻毒后,部分仔猪蹄部出现水疱、跛足等临床症状,观察7日的统计结果显示,SVA-HN16试验组5/5发病,SVA-HN16/2试验组3/5发病。

表3 不同毒株攻毒发病情况

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图2  HN16病毒株攻毒后试验猪发病图片

3.5 免疫原性试验  28~35日龄健康易感仔猪分别接种两株猪塞内卡病毒制成的灭活疫苗,二免14日后仔猪血清中和抗体水平表明免疫SVA-HN16试验组的中和抗体水平最高,结果见表5。根据3.4的结果,因SVA-HN16的毒力为两株中最强,则选定其为攻毒毒株,对两组试验组及对照组进行后海穴注射攻毒。攻毒保护情况见表6,其中SVA-HN16疫苗组的攻毒保护为5/5。

表5 二免14日后血清中和抗体水平

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表6 攻毒保护统计结果表

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以上致病性试验及免疫原性试验结果表明SVA-HN16毒株可以作为疫苗生产用候选毒株。

4 小结

本试验从疑似SVA的3份PCR阳性病料中分离到3株病毒,通过PCR检测和致病性试验,证明3株病毒均为猪塞内卡病毒(SVA),将3株分别命名为SVA-HN16、SVA-HN16/1、SVA-HN16/2株。对3株病毒株进行鉴定,结果表明3株SVA病毒株均无细菌、支原体及外源病毒污染。3株病毒均能适应PK15-HN细胞,其中SVA-HN16毒株病毒含量大于其它2个毒株。动物致病性试验结果表明,SVA-HN16毒株可引起试验猪全部发病,并表现典型的临床症状,致病性最强。从免疫原性试验结果来看,将SVA-HN16毒株制备成灭活疫苗免疫仔猪其免疫保护效果。

结果试验表明,将SVA-HN16毒株作为猪塞内卡病灭活疫苗生产用候选毒株。

(作者简介:贺大芳,硕士,华派生物研发中心)

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