猪瘟E2蛋白免疫效果研究

引言

尽管猪瘟已在欧美国家净化根除，猪瘟在我国仍零星散发，预防控制猪瘟主采用疫苗接种。当前使用的猪瘟疫苗主要为猪瘟兔化弱毒株（C株）生产的细胞苗（细胞苗）和组织苗（脾淋苗）。由于生产猪瘟兔化弱株细胞苗需要用到细胞或家兔，生产成本高，生产不稳定，易受到外源病毒污染（细胞苗易受到BVDV污染，组织苗易受到兔病毒性出血病病毒污染）。同时由于动物疫苗生产技术不断向前发展，表达的猪瘟E2蛋白疫苗因生产成本相对较低，生产过程中不涉及到活病毒，不易受到非禽源外源病毒污染，因而受到动物疫苗生产企业的重视。当前我国有一种获批的猪瘟E2蛋白疫苗，该E2蛋白为昆虫杆状病毒系统表达的猪瘟E2蛋白，其表达量不高，表达量为100～200μg/ml。目前我们正在开发一种以CHO细胞表达猪瘟E2蛋白，表达量高，表达量为1～2mg/ml，大大降低了生产成本。本文就以CHO细胞表达的猪瘟E2蛋白进行安全性和有效性研究，力求开发一种新型猪瘟候选疫苗。

1 材料

猪瘟E2蛋白  由苏州世诺生物技术有限公司提供

猪瘟活疫苗  由华派生物工程集团有限公司提供

ST细胞  由华派生物工程集团有限公司提供

猪瘟单克隆抗体  WH301 购自北京

猪瘟ELISA抗体检测试剂盒  购自IDEXX公司

试验动物  无母源抗体仔猪（ELISA抗体检测为阴性），购自庭院养殖；有母源抗体仔猪（ELISA抗体检测为阳性），购自小型农场。

2 方法

2.1 猪瘟E2蛋白稀释液选择  将猪瘟E2蛋白用不同的稀释液稀释成100μg/ml，接种21～28日龄无母源抗体仔猪，接种后不同时间采血，检测中和抗体和ELISA抗体。

2.2 猪瘟E2蛋白安全性研究  将猪瘟E2蛋白用10% X稀释成200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml，分别接种有和无母源抗体仔猪（21日～28日龄），接种后观察1日。观察内容：接种时仔猪接种后仔猪有无应激（呕吐、颤抖、呼吸急促、皮肤发红、痉挛、倒地），观察接种后24小时内仔猪采食是否正常。

2.3 猪瘟E2蛋白有效性研究

2.3.1 根据安全性和E2蛋白佐剂选择的结果，以10%X为稀释液，E2蛋白固定在50μg/ml，与猪瘟活疫苗比较。接种21～28日龄有母源抗体仔猪，接种后21日、28日和二免后14日采血，检测ELISA抗体，以中ELISA抗体阳性率和阻断率为指标，判定猪瘟E2蛋白的免疫效果。

2.4 猪瘟中和抗体检测方法  将分离后的血清在56℃下灭活30分钟， 取50μl血清，在96孔板上按列进行2倍系列稀释，稀释至1:212，将猪瘟C株细胞毒稀释成2000TCID50/ml，每孔加入50μl，37℃下作用60分钟，每孔加入100μl细胞悬液，37℃，5%CO2培养90～96小时。弃培养液，加入100μl（甲醇：丙酮=1:1）固定液-15℃下固定40分钟、弃固定液，自然风干或吹干，然后加入用5%脱脂乳1:1000稀释WH303单抗，37℃作用90分钟，以PBS洗5次，加入FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃作用60分钟，PBS洗5次，倒置显微镜下观察。以能完全中和100TCID50猪瘟病毒的血清最高稀释度作为该血清的中和抗体效价。

2.5 ELISA抗体检测方法  按厂家说明书进行操作。

3 结果

3.1 佐剂的选择  本次试验所用到的稀释液为PBS、1%gel+0.5%PTK、10%X。从表1的结果来看，在首免后7日，以10%X作为稀释液的免疫效果较好，ELISA阳性率为6/7，PBS作为稀释液的免疫效果较差，ELISA阳性率在首免后28日阳性率才打到6/7；以1%gel+0.5%PTK在首免后14日升高到4/7。这说明以ELISA阳性率作为标准，10%X作为E2蛋白的稀释液，其免疫效果较好。从表2的结果来看，在首免后7日，以X作为稀释液的中和抗体算数平均值为2，其余稀释液的中和抗体都较低。在首免后14、21、28和35日，都是以10%X作为稀释液的中和抗体水平较高。这一结果说明以中和抗体为标准，10%X作为E2蛋白的稀释液，其免疫效果较好，这一结果与ELISA结果一致。因此拟选用X作为E2蛋白的稀释液。

3.2 安全性试验结果  

共进行了7次安全性试验，E2蛋白含量从50μg/ml～200μg/ml，第1～4次试验E2蛋白分未纯化，第5～7次E2蛋白纯化。母源抗体分为有和无，第1、2次试验仔猪无母源抗体，第3～7次试验仔猪有母源抗体；第1、2次试验采用首免加二免方式。

在第1、2次试验，接种剂量都为100μg/ml，首免时猪为无母源抗体仔猪。在首免时，应激比例为0/28和0/21，但都出现减食现象。而二免时，都出现呕吐。第3、4次试验，接种剂量为100μg/ml，仔猪含有母源抗体，接种后24/24和32/32出现应激，表现为呕吐、抽搐、倒地。

第5～7次试验，E21蛋白经过纯化，第5次试验接种剂量为200μg，第6、7次试验接种剂量为50μg。第5次试验接种后11/22出现应激，第6次试验接种后1/43出现应激，第7次试验0/35出现应激。

从结果来看，第1、2次试验首免时未出现应激，仅表现为减食，而在二免后出现轻微呕吐（应激现象之一），说明二免时比首免时应激较为严重。第3、4次试验使用的剂量也为100μg/ml，接种时仔猪含有母源抗体，与第1、2次试验相比，其首免时应激反应更为严重。这说明仔猪在有母源抗体时，对E2蛋白的反应更为严重。从第1、2次试验二免时仅出现轻微呕吐，而第3、4次首免时出现严重应激，其可能原因是二免时仔猪日龄大约为35-42日龄，首免时仔猪日龄为21-28日龄，这可能说明仔猪日龄越小，E2蛋白对较小日龄的仔猪的安全性越低。

从第5次与第3、4次结果来看，第5次接种剂量为200μg/头，其应激比例为11/22，而第3、4次应激比例分别为24/24和32/32。第5次与第3、4次试验差异为接种剂量和E2蛋白是否纯化，第5次接种剂量大，蛋白纯化，3、4次接种剂量小，蛋白未纯化，其应激比例第3、4次更高，说明未纯化的E2蛋白对仔猪的安全性较低。

第6、7次与第5次试验的差异在于接种剂量，这说明接种50μg/头，E2蛋白对仔猪较为安全。

3.3 有效性试验结果  

一共进行了7次有效性试验。第1～5次猪仅接种1次，在接种时、接种后21日、28日采血测ELISA抗体，比较不同佐剂、E2蛋白不同保存方式、猪瘟活疫苗中添加E2蛋白与E2蛋白对比、不同浓度的X稀释免疫效果对比。从1～5次的试验结果来看，去除首免时母源抗体水平因素，如果仅接种1次，在不同时间采血，检测ELISA抗体阳性率，不能有效比较不同变量对免疫效果的影响。因此在第6、7次试验采用接种2次后在不同时间采样，比较不同变量对免疫效果的影响。

第6次试验，在首免时，活疫苗+E2组ELISA阳性率和阻断率较低，E2组与活疫苗组ELISA阳性率和阻断率较为接近（阳性率4/9Vs5/9，阻断率36.19%Vs39.76%），在二免时活疫苗+E2组阳性率7/7，阻断率77.68%，E2与活疫苗组阳性率、阻断率都有升高；在二免后14日，E2+活疫苗组阳性率为7/7，阻断率为92.42%，E2组阳性率为8/9，阻断率为80.28%，活疫苗组阳性率为5/9，阻断率为53.37%。这一结果表明，以ELISA阳性率和阻断率的高低判定猪瘟疫苗的免疫效果，则E2+活疫苗、E2的免疫效果明显优于活疫苗的免疫效果。

为了进一步验证第6次试验的效果，进行了第7次试验。首免时活疫苗+E2蛋白组阳性率13/13，阻断率为79.22%，与活疫苗组相似（阳性率10/10，阻断率75.31%），E2蛋白组阳性率为0/9，阻断率为23.25%；二免时，活疫苗+E2组疫苗以及活疫苗组阳性率和阻断率都下降，E2组阳性率、阻断率都上升；在二免后14日活疫苗+E2组以及E2组阳性率和阻断率都上升至12/12、9/9和82.27%、83.06%，而活疫苗组阳性率为6/10，阻断率为45.95%。这一结果说明，以ELISA阳性率和阻断率为标准，活疫苗+E2和E2蛋白组的免疫效果明显优于活疫苗组。

4 讨论与结论

4.1 从佐剂筛选的结果来看，以10%的X作为稀释液，稀释的猪瘟E2蛋白接种非免猪后，免疫效果优于活疫苗。

4.2 从有效性试验的结果来看，猪瘟E2蛋白接种1次后采样，根据ELISA阳性率和阻断率的高低，评价疫苗的优劣存在局限性和不确定性（可能受到母源抗体的影响、疾病因素的影响）；从接种2次，在二免后14日采样，根据ELISA阳性率和阻断率的高低，能有效比较疫苗的优劣（第6、7次有效性）。

4.3 从安全性试验结果来看，未纯化猪瘟E2蛋白接种有母源抗体仔猪，其剂量超过100μg/头/次，猪只应激比例较高，其安全性不可接受；纯化的E2蛋白接种有母源抗体仔猪，其剂量200μg/头/次，猪只应激比例仍较高，因此纯化与否是影响E2蛋白对仔猪安全性的重要因素。在试验中发现，5%的X稀释活疫苗（1头份/ml）、E2蛋白（50μg/ml）、E2蛋白+活疫苗（1头份+50μg/ml），都可能引起接种仔猪发生应激反应（数据未显示），尽管试验未比较以PBS稀释这三种疫苗接种仔猪是否会引起应激反应，但从经验上可以推测主要是由5%的X所致。因此尽管5%的X稀释E2蛋白接种仔猪的免疫效果较好，但以该稀释液稀释猪瘟E2蛋白作为疫苗，可能会导致其安全性不可接受。因此我们有必要寻求另外的稀释液或调整X的浓度，比较二免后免疫效果，以提高猪瘟E2蛋白疫苗的有效性和安全性。

4.4 由于每次试验仔猪的数量有限，不能将不同参数都纳入同一次试验中进行比较，这可能影响结果分析。在有效性试验的比较中，主要采用ELISA阳性率和阻断率作为评价标准，这可能存在局限性。

由于ELISA检测试剂盒包被的为E2蛋白，检测E2蛋白免疫反应更加具有针对性，检测猪瘟活疫苗免疫反应仅针对猪瘟活疫苗病毒粒子上E2蛋白的免疫反应，不能检测猪瘟活疫苗其它抗原成分的免疫反应，从而导致以ELISA阳性率和阻断率的大小比较猪瘟活疫苗与E2蛋白免疫效果的优劣存在不公正性。因此我们有必要采用金标准方法，比如中和抗体法或免疫攻毒法作为比较猪瘟活疫苗与E2蛋白免疫效果评价的标准。

参考文献

（略）

（作者简介：徐静，博士，华派生物研究院）