O型口蹄疫病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫原性分析

摘要  为构建表达O型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组杆状病毒，将P12A3C基因克隆入高效转移载体pFBTB中，构建重组转移质粒pFBTB-P12A3C，将其转化DH10Bac感受态细胞，获得重组杆粒Bacmid-P12A3C。将该重组杆粒转染Sf9细胞，制备重组杆状病毒rBac-P12A3C。Western blot和IFA检测表明，获得的重组杆状病毒在Sf9细胞中能够表达O型FMDV衣壳蛋白。用纯化的衣壳蛋白抗原制备疫苗免疫仔猪，免疫动物均产生了较高的特异性抗体，结果表明制备的衣壳蛋白抗原具有良好的免疫原性。本研究为开发O型FMDV空衣壳疫苗奠定了基础。

关键词   O型口蹄疫病毒；衣壳蛋白；重组杆状病毒

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由FMD疫病毒(FMDV)引起偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为实时通报的疫病。FMDV属于微RNA病毒科口蹄疫病毒属成员，病毒基因组为单股正链RNA，全长约8.5kb，基因组RNA只有一个大的开放阅读框，编码一个多聚蛋白。其中，结构蛋白P1在3C蛋白酶作用下裂解为VP0、VP3、VP1，VP0进一步裂解为VP4和VP2，这些单体蛋白与FMDV RNA组装成为成熟的146S病毒粒子[1]。

疫苗接种是预防FMD的有效措施。FMDV灭活疫苗在控制FMD的过程中发挥了重要的作用，但该疫苗在生产过程中大量增殖强毒，存在散毒的风险。研究表明，FMDV空衣壳与病毒粒子具有相似的免疫原性，由于病毒空衣壳不含核酸成分，安全性好，不存在散毒风险。因此，研制FMDV空衣壳疫苗显得极为重要。杆状病毒表达系统是大规模生产病毒空衣壳的优选体系，本研究采用改造的Bac-to-Bac系统，构建表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒，并在Sf9细胞中获得比较高效的表达，为研制O型FMDV空衣壳疫苗奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌种和细胞  pT-P12A3C质粒、pFBTB质粒[2]由华派生物工程集团有限公司构建并保存。DH10Bac感受态细胞和Sf9细胞由华派生物工程集团有限公司保存。

1.1.2 主要试剂  HRP标记的羊抗猪IgG、FITC标记的羊抗猪IgG购自Sigma公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自Thermo Fisher公司；SF-SFM培养基购自苏州市沃美生物技术有限公司；口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

1.1.3 试验动物  1月龄左右仔猪（O型FMDV抗体效价<1:16）由华派生物工程集团有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 重组杆粒Bacmid-P12A3C的构建  用SalI和XhoI双酶切pT-P12A3C质粒，将P12A3C基因克隆入pFBTB的SalI/XhoI位点处，经酶切验证正确后命名为pFBTB-P12A3C。将重组转移质粒pFBTB-P12A3C转化DH10Bac感受态细胞，通过蓝白斑筛选，挑取白色菌落，提取重组杆粒，用通用引物M13F和M13R进行PCR鉴定。

1.2.2 重组杆状病毒rBac-P12A3C的构建  将提取的重组杆粒Bacmid-P12A3C用转染试剂Lipofectamine 2000转染对数生长期的Sf9细胞，27℃培养，待出现细胞病变后，收取病变的细胞培养上清，将收取的上清作为第1代的重组杆状病毒rBac-P12A3C。

1.2.3 Western Blot分析  将接种重组杆状病毒的Sf9细胞裂解物进行SDS-PAGE电泳后，转印至硝酸纤维素膜，用5%脱脂乳封闭，以O型FMDV猪阳性血清（1:100）为一抗，HRP标记的羊抗猪IgG（1:1000）为二抗，用DAB溶液进行显色鉴定。

1.2.4 间接免疫荧光检测  将重组杆状病毒接种Sf9细胞，72h后，用预冷的无水乙醇固定30min，以O型FMDV猪阳性血清（1:50）为一抗，FITC标记的羊抗猪IgG（1:100）为二抗，在荧光显微镜下观察。

1.2.5 免疫动物  将收获的Sf9细胞培养物离心后，取上清用离子交换层析方法进行纯化，并与适量的Montanide ISA206佐剂混合制备疫苗。将1月龄左右仔猪（O型FMDV抗体效价<1:16）15头，随机分为3组，5头/组，分别颈部肌肉接种空衣壳疫苗、猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗和灭菌生理盐水，2mL/头。一免28d后，以相同剂量进行二次免疫。

1.2.6 血清抗体测定  收集免疫前和免疫后14、21、28、35d的猪血清，采用液相阻断ELISA检测试剂盒检测血清抗体水平。

2 结果

2.1 重组杆状病毒rBac-P12A3C的构建  将重组杆粒Bacmid-P12A3C转染Sf9细胞5d后，细胞出现变大、脱落等明显的细胞病变效应，收获病变的细胞培养上清为第1代重组杆状病毒rBac-P12A3C。

2.2 Western Blot分析  结果显示在33kDa、24kDa、23kDa处出现明显的目的条带，这三个条带与VP0、VP1和VP3分子量大小相符（图1），表明重组杆状病毒rBac-P12A3C能够表达FMDV衣壳蛋白。

图1 Western Blot检测FMDV衣壳蛋白的表达

1：感染重组杆状病毒rBac-P12A3C的细胞裂解物；

2：感染野生型杆状病毒的细胞裂解物；3：预染蛋白质Marker

2.3 间接免疫荧光检测  结果显示感染重组杆状病毒的Sf9细胞具有明显的绿色荧光，而野生型杆状病毒感染的Sf9细胞不显示荧光（图2），表明该重组杆状病毒能够在Sf9细胞中表达O型FMDV衣壳蛋白。

图2 IFA检测FMDV衣壳蛋白的表达

A：感染重组杆状病毒rBac-P12A3C的Sf9细胞；B：感染野生型杆状病毒的Sf9细胞

2.4 抗体水平检测  液相阻断ELISA结果表明，空衣壳疫苗组和灭活疫苗组仔猪抗体水平在一免后14d后均有不同程度升高，21d和28d后抗体水平大多维持在较高水平，二免后7d两组抗体水平均有明显升高。而生理盐水组仔猪抗体水平免疫后未见提高。

3 讨论

昆虫杆状病毒表达系统（BEVS）表达效率高，表达的蛋白生物学功能与天然蛋白相似，可以全悬浮培养，是大规模生产表达FMDV空衣壳蛋白的最优体系之一。然而，有两个主要因素限制了其工业化应用，一是与其他表达系统（g/L）相比，BEVS表达量相对较低（低于50-100mg/mL[3]）；二是由于细胞病变效应造成的蛋白降解。目前许多研究聚焦于提高BEVS的蛋白产量和稳定性，Silvia等[4]通过在杆状病毒转移载体pFastbac Dual中引入含有杆状病毒顺式作用元件IE0/IE1、增强子序列hr1和p6.9p10嵌合启动子的表达盒TB，构建了重组杆状病毒转移载体pFBTB。该新型表达盒TB通过延长感染细胞的完整性（减少蛋白降解和变异体产生）和提高蛋白完整性，显著提高了BEVS的蛋白产量，比标准杆状病毒载体产量高4倍。Javier等[5]利用转移载体pFBTB制备PCV2-Cap和RHDV-VP60 VLPs，结果显示蛋白产量显著提高（大约300%），而且感染细胞中蛋白表达时间能延长至少24h。

本研究采用新型表达盒TB构建了高效表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒，Western blot和IFA结果显示O型FMDV衣壳蛋白在Sf9细胞中表达成功，动物免疫试验结果显示其具有良好的免疫原性。本研究为研制O型FMDV空衣壳疫苗奠定了基础。

参考文献

[1]  Grubman M J, Baxt B. Foot-and-mouth disease [J]. Clin Microbiol Rev, 2004, 17(2): 465-493.

[2]  Gómez-Sebastián S, López-Vidal J, Escribano JM (2014) Significant Productivity Improvement of theBaculovirus Expression Vector System by Engineering a Novel Expression Cassette. PLoS One 9:e96562.

[3]  Vicente T, Roldao A, Peixoto C, Carrondo MJ, Alves PM (2011) Large-scale production and urification of VLP-based vaccines. J Invertebr Pathol 107 Suppl: S42-48.

[4]  Gómez-Sebastián S, López-Vidal J, Escribano JM (2014) Significant Productivity Improvement of the Baculovirus Expression Vector System by Engineering a Novel Expression Cassette. PLoS One 9:e96562.

[5]  López-Vidal J, Gómez-Sebastián S, Bárcena J, et al. Improved production efficiency of virus-like articles by the baculovirus expression vector system[J]. PloS one, 2015, 10(10): e0140039.